Modele eksperymentalne do badania fizjologii i patofizjologii nabłonka pigmentowego siatkówki

Ogólnym celem tej procedury jest wytworzenie kultur ludzkiego płodowego nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE), które mogą służyć jako model. W badaniach nad chorobami ludzkiego oka tkanki są otrzymywane od dawców w postaci całych gałek ocznych. Pierwszym krokiem procedury jest odcięcie nadmiaru mięśni i tkanki łącznej, a następnie otwarcie oka poprzez usunięcie rogówki i soczewki.

Gałkę oczną traktuje się dyspazą i spłaszcza, a następnie warstwę pojedynczą RPE oddziela się od naczyniówki. Wypreparowane RPE wysiewa się do kolb i hoduje przez kilka tygodni, aż utworzą konfluentne monowarstwy i wykształcą pigment. Hodowle komórkowe są wykorzystywane w in vitro eksperymentach funkcjonalnych.

Udałe eksperymenty in vitro są powtarzane w zwierzęcych modelach badań przedklinicznych, w których odpowiedzi RPE można lepiej ocenić w bardziej złożonym środowisku sygnałowym. Model zaprezentowany w niniejszym materiale przyczyni się do lepszego zrozumienia fizjologii RPE oraz opracowania nowych interwencji terapeutycznych w leczeniu chorób oczu. Witam, nazywam się Sheldon Miller.

Moje laboratorium znajduje się w National Eye Institute, który jest częścią National Institutes of Health na kampusie w Bethesda w stanie Maryland. Cześć, jestem Arki z laboratorium Millera. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę przygotowania pierwotnych kultur ludzkich płodowych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki.

Komórki te zostaną przygotowane w formie konfluencyjnych monowarstw, które można umieścić w zmodyfikowanych komorach sing. Odizolowane ludzkie komórki RPE zostaną wykorzystane również w badaniach z zakresu biochemii i genetyki. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium w celu tworzenia kultur pierwotnych komórek nabłonkowych, aby badać funkcję i regulację procesów fizjologicznych i patofizjologicznych oraz opracowywać kliniczne modele zwierzęce chorób.

Skupiamy się na nabłonku pigmentowym siatkówki (RPE), który znajduje się w tylnej części oka, oddzielając siatkówkę nerwową od naczyniówki. Ten schemat oka przedstawia lokalizację warstwy RPE w tylnej części oka, bezpośrednio przylegającej do fotoreceptorów. Wstawka pokazuje komórki siatkówki z fotoreceptorami po prawej stronie i komórkami zwojowymi po lewej.

Nabłonek ten jest niezwykle aktywny metabolicznie. Nieprzerwanie, w cyklu dobowym, fagocytuje fotoreceptory oraz magazynuje, przekształca i transportuje witaminę A, będącą pigmentem wzrokowym, do fotoreceptorów. W cyklu wzrokowym pełni on funkcję homeostatyczną, utrzymując skład chemiczny i objętość otaczających przestrzeni zewnątrzkomórkowych.

Kluczową właściwością nabłonka jest jego polarność. Ciągły, asymetryczny transport białek do błon apikalnej i bazolateralnej jest procesem regulowanym, który umożliwia nabłonkowi wektorowy transport metabolitów, jonów i płynów z jednej przestrzeni zewnątrzkomórkowej do drugiej. Działanie to pomaga nabłonkowi utrzymać zdrowie i integralność siatkówki nerwowej.

Opisane tutaj przygotowanie in vitro umożliwia analizę białek transportowych, receptorów oraz szlaków sygnalizacyjnych determinujących polaryzację i funkcję nabłonka przed rozpoczęciem sekcji. W komorze z laminarnym przepływem powietrza przygotować płytkę 12-dołkową z roztworami w temperaturze pokojowej. Dla każdego oka wymagany jest jeden dołek z 10 x roztworem antybiotykowo-antymykotycznym, dwa dołki z 1 X PBS oraz jeden dołek z 2 U/ml dyspazy rozcieńczonej w podłożu 5% RPE z surowicą. Naczynie sekcyjne z silikonową podkładką wypełnić 1 X HBSS, odlać ciecz i przenieść każde oko do osobnego dołka z roztworem antybiotykowo-antymykotycznym.

Inkubować od trzech do pięciu minut w temperaturze pokojowej. Unikać wywierania nadmiernego nacisku na gałkę oczną. Przepłukać oko w dwóch kolejnych dołkach z XPBS, aby usunąć nadmiar antybiotyku.

Następnie za pomocą pęsety przenieś go do naczynia sekcyjnego wypełnionego roztworem X-H-B-S-S, korzystając ze stereomikroskopu sekcyjnego. Za pomocą nożyczek irydowych usuń nadmiar mięśni i tkanki łącznej wokół oka. Ustaw oko tak, aby rogówka była skierowana ku górze.

Używając dwóch sterylnych igieł o rozmiarze 27 G, przymocuj gałkę oczną do silikonowej podkładki, przebijając tkankę łączną w sposób, który nie uszkodzi twardówki. W tej orientacji użyj noża do bocznego portu, aby wykonać nacięcie twardówki. Cięcie powinno znajdować się w odległości jednej trzeciej dystansu od równika oka do powierzchni przedniej.

Za pomocą nożyczek irydowych kontynuuj cięcie okrężnie wokół oka, aby uniknąć uszkodzenia nabłonka barwnikowego siatkówki (w skrócie RPE) przez przyciąganie ciała szklistego do siatkówki. Użyj tych samych nożyczek, aby przeciąć ciało szkliste i oddzielić przednią klapę oka od oczodołu.

Podnieś przednią część IOA i usuń ją. Za pomocą pęsety przenieś otwarte oko do dołka z dys. Upewnij się, że w oku nie ma pęcherzyków powietrza.Cup.

Inkubować od 40 do 60 minut w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2. Przenieść oko z przestrzeni do inkubacji z powrotem do naczynia sekcyjnego wypełnionego świeżym, 1X HBSS w temperaturze pokojowej. Ustawić oko czarą skierowaną do góry i unieruchomić je za pomocą dwóch igieł o rozmiarze 27G.

Pod mikroskopem stereoskopowym, używając precyzyjnej pincety, ostrożnie unieś częściowo oddzieloną siatkówkę za pomocą nożyczek do siatkówki. Odetnij siatkówkę od nerwu wzrokowego. Usuń siatkówkę za pomocą nożyczek do tęczówki.

Wykonaj nacięcie od obwodu oka do nerwu wzrokowego. Rozepnij oko, używając 5 igieł o rozmiarze 27 G. Aby rozciągnąć warstwę RPE, użyj nożyczek do siatkówki, aby wykonać okrężne cięcie wokół nerwu wzrokowego.

Oddzielenie warstwy RPE przy powiększeniu 250x lub większym. Znajdź krawędź płata RPE wzdłuż nacięcia wykonanego nożyczkami do tęczówki, blisko nerwu wzrokowego. Użyj dwóch par pęset, aby oddzielić RPE i błonę Brucha od warstwy tkanki naczyniówki.

Sprawdź kilka obszarów wzdłuż krawędzi cięcia, aby znaleźć miejsce, w którym połączenie między RPE a naczyniówką jest najsłabsze. Ostrożnie odklej błonę, aby całkowicie ją usunąć. Umieść płaty RPE w 15 mililitrowej probówce stożkowej wypełnionej trypsyną z EDTA w temperaturze pokojowej.

Po zebraniu wszystkich arkuszy, zakręć probówkę i inkubuj ją w kąpieli wodnej przez 10 minut w temperaturze 37 °C. Energicznie wstrząśnij probówką, aby rozdzielić RPE na małe klastry. Brak ciemnych skupisk komórek oznacza, że proces rozdzielania został zakończony.

Wróć probówkę do kąpieli wodnej na kolejne pięć minut. Za pomocą pastera, pipety i delikatnego ssania usuń wszelkie nieprzetrawione resztki tkanki. Odwiruj komórki w wirówce przy 280 5G przez cztery minuty.

Usunąć nadsącz. Uzupełnić końcową objętość do 9 mL za pomocą pożywki 15% RPE, pipetując w celu resuspensji. Przenieść 3 mL zawiesiny komórkowej do kolby o powierzchni 25 cm².

Dodaj 2 mL świeżego pożywki RPE 15% w temperaturze pokojowej. Inkubuj komórki przez noc w 37 °C i 5% CO2. W miarę dojrzewania kultur ich pigmentacja będzie wzrastać przez okres od trzech do czterech tygodni.

Pomyślnie wyhodowane kultury będą konfluentne i jednolicie, intensywnie zabarwione. Przedstawiliśmy właśnie sposób przygotowania pierwotnych kultur ludzkiego płodowego RP. To wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.