Selekcja aptamerów bez użycia starterów z wykorzystaniem losowej biblioteki DNA

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zidentyfikowanie aptamerów z losowej biblioteki, które specyficznie wiążą się z białkiem docelowym, w tym przypadku z białkiem S 100 B. Jest to realizowane poprzez wstępne trawienie biblioteki endonukleazą restrykcyjną w celu uwolnienia losowych sekwencji z flankujących je stałych sekwencji starterów. Drugim krokiem procedury jest związanie losowych sekwencji z biblioteki z oczyszczonym białkiem S 100 B i ich odzyskanie.

Trzecim krokiem procedury jest ponowne połączenie związanych sekwencji z unieruchomionymi sekwencjami starterów poprzez hybrydyzację i ligację. Ostatnim etapem procedury jest transkrypcja produktów ligacji w celu umożliwienia reamplifikacji związanej puli kandydujących abers za pomocą R-T-P-C-R, a następnie przeprowadzenie kolejnych rund tej procedury selekcyjnej. W rezultacie można uzyskać wyniki wykazujące specyficzne wiązanie wybranych abers z białkiem S 100 B.

Na przykład w tym przypadku testy wiązania typu kanapkowego są przeprowadzane z wykorzystaniem mikromacierzy, a testy z użyciem wtórnych przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie są również przeprowadzane przy użyciu funkcjonalizowanych nanodrutów oraz wtórnych przeciwciał sprzężonych z 15 nanometrowymi nanocząsteczkami złota. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę wyboru optymalnych przeciwciał, które wiążą białko S100B z losowej biblioteki sekwencji DNA. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium w wielu celach, w tym do opracowania platformy sensorycznej do wczesnego wykrywania nowotworów.

Zacznijmy zatem. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować bibliotekę DNA wolną od starterów (PF), zgodnie z wcześniejszym opisem. Rozszczepienie dwuniciowej biblioteki DNA, a następnie oczyszczanie żelowe za pomocą 10% denaturującego żelu poliakrylamidowego, pozwoli uzyskać fragment 32 nukleotydów z grupą fosforanową na końcu 5' w pozycji 30 oraz fragment 30 nukleotydów z grupą fosforanową na końcu 5' w pozycji 30, określane odpowiednio jako fragmenty 32 plus i 30 plus.

Fragment 32 plus zawiera 30-nukleotydową domenę randomową z minimalną sekwencją flankującą CC na końcu 3', podczas gdy fragment 30 plus składa się wyłącznie z sekwencji 30-nukleotydowej domeny randomowej. Aby przygotować fragmenty DNA biblioteki PF do selekcji aptr, należy resuspendować każdy z fragmentów 32 plus oraz 30 plus w 40 µL 20 mM Tris-HCl pH 7,4. Następnie próbki należy podgrzewać przez trzy minuty w temperaturze 85 °C po inkubacji.

Próbki inkubowano przez trzy minuty w kąpieli wodnej w temperaturze 37 °C, następnie dodano 760 µL buforu selekcyjnego i inkubowano przez trzy minuty w temperaturze 37 °C. Po trzech minutach próbkę pozostawiono w temperaturze pokojowej na 10 minut. Po inkubacji roztwór przepuszczono przez kolumnę zawierającą kule agarowe Ni-NTA, uprzednio przemyte buforem selekcyjnym.

Aby usunąć niespecyficzne DNA, należy zebrać fragmenty DNA z biblioteki PF, które nie związały się z kolumną, i odłożyć je na później. Aby przygotować koraliki z wiążącym białkiem S 100 B, w pierwszej kolejności należy odwirować 400 µL koralików niklowych NDA przez trzy sekundy w mikrowirówce i odrzucić nadosad. Następnie koraliki należy przemyć 400 µL buforu wiążącego, delikatnie pipetując pięć razy.

Następnie odwiruj kuleczki i odlej nadsącz. Powtórz tę czynność. Przepłucz dwukrotnie.

Następnie przelej wcześniej oczyszczone białko z tagiem histydynowym przez kuleczki. W tym przypadku zastosowano ludzkie białko S100 wiążące wapń B. Delikatnie pipetuj roztwór w górę i w dół pięć razy co trzy minuty przez łącznie 15 minut.

Po 15 minutach odwiruj kuleczki i odlej nadsącz. Na koniec przemyj związane z kuleczkami S 100 B 400 µL buforu selekcyjnego, delikatnie pipetując ciecz w górę i w dół trzy razy. Ponownie odwiruj kuleczki i odlej nadsącz.

Powtórz ten krok dwukrotnie, aby w sumie przeprowadzić trzy końcowe płukania w celu wyselekcjonowania przeciwciał związanych z S 100 B. Odzyskaj fragmenty 32 plus i 30 plus, które zostały wcześniej odłożone. Dodaj fragmenty do S 100 B związanego z kuleczkami. Następnie inkubuj próbkę przez 15 minut.

Mieszając co trzy minuty poprzez delikatne pipetowanie w górę i w dół, a po 15 minutach krótko wirując kuleczki w celu ich osadzenia, odrzuć supernatant, a następnie przemyj kompleks S 100 BDNA 800 mikrolitrami buforu selekcyjnego, delikatnie pipetując. Następnie odwiruj kuleczki i odrzuć supernatant. Powtórz ten etap płukania dwukrotnie.

Aby odzyskać S 100, należy dodać do kuleczek 200 µL 20 mM TRIS-HCl o pH 7,4. Następnie zawiesinę należy podgrzewać przez trzy minuty w temperaturze 85 °C. Po inkubacji.

Mieszaj kulki na wirówce typu vortex przez jedną minutę, a następnie odwiruj je. Następnie przenieś nadsącz do nowej probówki. Powtórz ten krok raz i połącz oba nadsącze.

Na koniec należy oczyścić wybrane fragmenty DNA. Produkty PCR należy dwukrotnie ekstrahować równą objętością fenolu, chloroformu i alkoholu izopropylowego. Następnie należy je wytrącić za pomocą 250 millimolar sodium chloride oraz 2,5-krotnej objętości 100%Ethanol w temperaturze minus 70 degrees Celsius przez 15 minut.

Wiruj z prędkością 21 000 GS w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 15 minut. Następnie odlej nadsącz. Skutecznie przemyj osad 75% etanolem.

Odwiruj przy 21 000 GS w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut i odrzuć supernatant. Osad wysusz w wirówce próżniowej przez trzy minuty po 10 rundach selekcji. Klonuj uzyskane fragmenty DNA amplifikowane metodą PCR do wektora PCR 2.1 topo otrzymanego z witrogen core.

Następnie przeprowadź sekwencjonowanie od 40 do 50 pojedynczych kolonii dla każdego z wybranych fragmentów N 30 cc oraz N 30, wykorzystując starter M 13 forward. Wybrane sekwencje wyrównaj za pomocą oprogramowania Infomax Vector NTI. Następnie, na podstawie otrzymanych wyrównań, wyznacz sekwencje konsensusowe.

Po zidentyfikowaniu sekwencji konsensusowych należy zakupić oligonukleotydy konsensusowe zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Pierwszy syntetyzowany aptamer z grupą Amin C6 na końcu 5' należy zawiesić w buforze do drukowania do końcowego stężenia 15 µM. Następnie należy nanieść roztwór aptameru na slajdy aktywowane CodeLink za pomocą matrycy mikroprzestrzennej Apogen Discoveries.

Należy postępować zgodnie z zalecanymi protokołami podanymi w linku do kodu. Każdy slajd należy wydrukować z 12 macierzami. Należy zastosować format dwa na osiem.

Kaseta do hybrydyzacji mikromacierzy przeznaczona do hybrydyzacji. Rozcieńczyć białko S 100 B do odpowiedniego stężenia w 70 µL PBS. Następnie nanieść roztwór do studzienek kasety mikromacierzy.

Uszczelnij kasetę z mikromacierzą za pomocą wolnej od nukleaz folii uszczelniającej, aby zapobiec odparowaniu. Pozostaw białko do związania z przeciwciałami naniesionymi na płytkę kodową. Inkubuj przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.

Przemyj dołki kasety trzy razy za pomocą PBS z 5 mM chlorkiem magnezu lub PBSM. Następnie rozcieńcz znakowane fluorescencyjnie przeciwciała wtórne do stężenia 0,125 µM w 70 µL PBSM. Podgrzewaj mieszaninę przez trzy minuty w temperaturze 85 °C.

Następnie należy schłodzić znakowane ABERS na lodzie. Przez trzy minuty nanosić ABERS do dołków kasety mikroarray. Ponownie uszczelnić kasetę folią klejącą i inkubować przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.

Ponownie, pojedynczo. Po przemyciu opłucz dołki trzy razy przy użyciu PBSM. Rozmontuj kasetę i wypłucz cały preparas PBSM.

Następnie należy dokładnie osuszyć preparat poprzez wirowanie. Na koniec skanuje się preparat przy użyciu skanera Packard Biosciences scan array. Wiązanie 4 000 XL określono dla aptamerów znakowanych na końcu 5' za pomocą gamma P 32 A TP w odniesieniu do białka S 100 B, a następnie nanieśli wyniki na wykres w funkcji stężenia w celu wyznaczenia KD.

Reprezentatywne wartości Kd po około siedmiu rundach selekcji znajdują się zazwyczaj w zakresie 10⁻⁷ M. Aptamery pierwszego celu 5' sprzęgnięto z mikromacierzami CodeLink. Oczyszczone białko S100B związano z pierwszym aptamerem, a następnie do kompleksów pierwszego aptameru z S100B przyłączono drugi aptamer znakowany LOR 546.

Fluorescencję zmierzono ilościowo za pomocą skanera tablicowego. Środkowy rząd przedstawia wiązanie typu „sandwich”, charakteryzujące się wiązaniem addytywnym w analizach KD w rzędach powyżej i poniżej. Brak wiązania typu „sandwich” dla abers pięcioprymowych pochodnych tiolowych; pierwsze abers zostały sprzęgnięte z nanodrutami złotymi przy użyciu standardowej chemii tiolowej.

Drugie przeciwciała sprzęgnięto z 50 nM złocistych nanocząsteczek w ten sam sposób. Następnie oczyszczone białko S 100 B związano najpierw z nanodrutami pochodnymi, a potem do kompleksów nanodrut-pierwsze przeciwciało-S 100 B związano 50 nM złocistych nanocząsteczek z drugim aptamerem. Powstałe kompleksy kanapkowe zwizualizowano za pomocą FE-SEM.

Kontrola negatywna została przedstawiona dla testu wiązania przeprowadzonego z białkiem HTRA one zamiast białka S 100 B. Jednym z najważniejszych aspektów tej procedury jest zastosowanie podejścia bezprimerowego, w którym nie używamy stałych sekwencji; zapobiega to powstawaniu wyników fałszywie dodatnich i fałszywie ujemnych, które mogłyby wystąpić, gdyby same sekwencje zdominowały region losowy. Podczas wykonywania tej procedury należy upewnić się, że matryca DNA została zniszczona przed każdą reakcją odwrotnej transkrypcji oraz zachować ostrożność przy izolowaniu konkretnego produktu RT-PCR po każdej reamplifikacji.

To wszystko. Dziękujemy za obejrzenie i powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.