Przewlekłe obrazowanie kory wzrokowej myszy z wykorzystaniem preparatu z pocienioną czaszką

Kolce dendrytyczne to wypustki błonowe dendrytu neuronu, które przyjmują sygnały synaptyczne. Wydłużanie, kurczenie, pojawianie się lub zanikanie kolców następuje w odpowiedzi na zmiany w funkcjonowaniu sieci neuronowej, które wynikają ze specyficznych wzorców aktywności neuronalnej. Zjawisko to, umożliwiające obserwację zmian morfologicznych w kolcach dendrytycznych, znane jest jako plastyczność kory.

U żywych zwierząt do czaszki myszy przymocowana jest płyta obrazująca. Obszar czaszki zostaje chirurgicznie odchudzony, a następnie wykonuje się obrazy przy małym i dużym powiększeniu. Następnie obszary te są ponownie obrazowane w późniejszych punktach czasowych.

Uzyskane wyniki pokazują, że morfologia kolców dendrytycznych może być wyraźnie wizualizowana przy użyciu preparatu z cienką czaszką w wielu punktach czasowych. Wykazano również, że morfologia kolców jest wysoce plastyczna, co objawia się zmianami w strukturze, a także pojawianiem się i zanikaniem kolców dendrytycznych. Cześć, nazywam się Emily Kelly i pracuję w laboratorium Anayi Maki w Departamencie Neurobiologii i Anatomii na Uniwersytecie w Rochester.

Dzisiaj przedstawimy procedurę chronicznego obrazowania kory wzgórzowej myszy po przygotowaniu tzw. okna czaszkowego. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania wymiany kolców dendrytycznych. Zacznijmy zatem.

Rozpocznij procedurę od sterylizacji narzędzi do chirurgii aseptycznej. Następnie zdezynfekuj obszar roboczy 70% ethanol i pokryj powierzchnię operacyjną czystym opatrunkiem. Monitoruj głębokość znieczulenia u myszy znieczulonej koktajlem z fentanylem, sprawdzając reakcję na uciśnięcie palca u stopy; mysz przedstawiona tutaj to mysz transgeniczna A-G-F-P-M, w której ekspresjonowane jest GFP.

W warstwie piątej znajdują się komórki parametalne, które wysyłają wypustki dendrytyczne do warstw powierzchownych. Aby utrzymać temperaturę ciała na poziomie 37,5 °C, umieść zwierzę na podgrzewającej macie i monitoruj ją za pomocą przymocowanego termometru rektalnego. Następnie, używając nożyczek, nałóż maść oftalmiczną do oczu, aby zapobiec ich wysychaniu.

Usuń sierść z tyłu głowy myszy, od miejsca za uszami aż do oczu. Następnie oczyść górną część głowy zwierzęcia, aplikując 70% etanol, a następnie szorując Betadyną i przemywając roztworem Betadyny. Wykonaj nacięcie LCU za uszami i w górę wzdłuż prawej lub lewej strony linii środkowej, w zależności od tego, która półkula będzie obrazowana, aż do oczu; odchyl skórę i złóż ją z dala od miejsca operacji.

Nie usuwaj skóry, ponieważ zostanie ona później zaszyta przy użyciu precyzyjnych pincet. Delikatnie odciągnij skórę w górę i odsuń ją od obszaru zainteresowania. Używając czystych pincet, delikatnie zeskrob okostną z odsłoniętego obszaru czaszki.

Nanieś niewielką ilość 10% chlorku cynku na czaszkę, aby całkowicie osuszyć błonę okostnową i upewnić się, że została ona w pełni usunięta. Ważne jest, aby czaszka była całkowicie sucha. Aby zapewnić odpowiednią przyczepność kleju, delikatnie zeskrob wysuszoną błonę okostnową za pomocą ostrza mikroschirurgicznego.

Następnie nanieś cienką warstwę akrylowego kleju Sano wokół okna obrazowania stalowej płytki głowowej i przytwierdź płytkę do czaszki. Za pomocą drewn ownego końca patyczka higienicznego nanieś klej na wewnętrzne krawędzie okna obrazowania, upewniając się, że wszystkie szczeliny między płytką obrazującą a krzywizną czaszki zostały wypełnione. Umieść kroplę akceleratora kleju w oknie.

Następnie szybko usuń nadmiar kleju. Pozostaw klej do całkowitego wyschnięcia. Używając wiertarki stomatologicznej z zamocowanym stalowym wiertłem o średnicy 0,7 mm, rozpocznij cieńczenie czaszki w oknie obrazowania.

Wiercenie należy przeplatać okresowym podawaniem 0,9% soli fizjologicznej, aby uniknąć nadmiernego przegrzania czaszki. Należy wyciąć okno o wymiarach 4x4 mm w czaszce, wykonując krótkie ruchy w poprzek jej powierzchni.

Za pomocą wiertła dentystycznego. Sprawdzić grubość czaszki, naciskając ją kleszczykami tępymi. Powierzchnia czaszki lekko ugnie się pod wpływem delikatnego nacisku.

Optymalna grubość czaszki dla obrazowania wynosi od 10 do 30 mikronów. Po ścienieniu czaszki należy oczyścić okno z wszelkich zanieczyszczeń i nanieść sól fizjologiczną na czaszkę. Należy sfotografować okno obrazowania za pomocą kamery cyfrowej zamontowanej na stereomikroskopie.

Układ naczyniowy mózgu na tej fotografii pomoże w zlokalizowaniu miejsca umieszczenia płyty obrazowej podczas kolejnych sesji obrazowania. Przenieś zwierzę do układu dwufotonowego. Zwierzę powinno pozostać na macie grzewczej, a temperatura ciała musi być stale monitorowana przez cały czas trwania sesji obrazowania.

Mikroskop dwufotonowy z laserem Mi Tai. Wykorzystano 10 watową pompę półprzewodnikową dla uzyskania maksymalnej mocy oraz zmodyfikowaną jednostkę konfokalną Olympus Flow View. System został zoptymalizowany do obrazowania głębokich tkanek, a detektory zewnętrzne zainstalowano jak najbliżej obiektywu, aby umożliwić maksymalną detekcję fluorescencji z mózgu; przy użyciu niskiego cyfrowego powiększenia dodaj kroplę soli fizjologicznej do okna obrazowania.

Za pomocą przymocowanej do mikroskopu kamery cyfrowej zidentyfikuj obszar zawierający intensywnie znakowane neurony. Następnie wykonaj zdjęcie obszaru obrazowania. Jest to niezbędne, aby móc powrócić do tego samego miejsca obrazowania w kolejnym punkcie czasowym.

Wykonaj stos obrazów przy niskim powiększeniu obejmujący cały widoczny zakres mózgu, aby ukazać stopień ramifikacji dendrytycznej. Posłuży to do lokalizacji obszaru obrazowania w kolejnych punktach czasowych, ponieważ zarówno naczynia krwionośne, jak i dendryty zachowują swoją strukturę u zwierząt młodych i dorosłych przy użyciu oprogramowania do obrazowania.

Zwiększ powiększenie cyfrowe ośmiokrotnie, w razie potrzeby skoryguj współrzędne XY i wykonaj stos obrazów przy dużym powiększeniu, aby ukazać szczegółową morfologię dendrytów, w tym lokalizację i strukturę kolców dendrytycznych. Sporządź szczegółowe notatki dotyczące każdego wykonanego stosu, uwzględniając współrzędne panowania, zakres akwizycji, wielkość kroku Z oraz liczbę kroków w stosie. Notatki te będą wykorzystane podczas powrotu do tego dendrytu lub aksonu w kolejnym punkcie czasowym.

Po zakończeniu obrazowania należy zdjąć płytkę głowową, delikatnie oddzielając ją od powierzchni czaszki za pomocą pęsety. Należy usunąć wszelkie pozostałości kleju i przemyć czaszkę 0,9% jałową solą fizjologiczną.

Zszyj skórę nad czaszką, używając nici chirurgicznej nr 6. Po zakończeniu procedury obrazowania przemyj ten obszar 70% etanolem. Umieść zwierzę w czystej klatce pod lampą grzewczą do czasu wybudzenia się i odzyskania sprawności ruchowej.

Następnie należy zwrócić zwierzę do jego pierwotnej klatki, aby powtórzyć obrazowanie w późniejszym punkcie czasowym, od dwóch dni do wielu miesięcy później; należy usunąć szwy i ponownie otworzyć skórę na głowie. Stosując metody aseptyczne, należy wykorzystać cyfrowy obraz naczyń krwionośnych mózgu wykonany podczas pierwszej operacji, aby zlokalizować pierwotne miejsce obrazowania. Następnie należy ponownie zamocować płytkę głowową w ten sam sposób co wcześniej.

W razie potrzeby użyj ostrza mikrosurgicalnego, aby delikatnie usunąć nadmiar kości, która mogła odrosnąć między punktami czasowymi obrazowania. Przetnij tkankę wiertłem dentystycznym, oczyść okno obrazowania z resztek i nanieś kroplę 0,9% jałowej soli fizjologicznej. Przenieś zwierzę do mikroskopu dwufotonowego i zlokalizuj pierwotny obszar obrazowania, korzystając z cyfrowego obrazu fluorescencyjnego wykonanego podczas poprzedniej sesji.

Uruchom program widoku przepływu. Otwórz oryginalny obraz przy niskim powiększeniu, przyłóż arkusz folii przezroczystej do ekranu komputera i naszkicuj główny wzór naczyń krwionośnych za pomocą pisaka do folii. Następnie otwórz obraz na żywo i wyrównaj układ naczyń krwionośnych z wzorem naszkicowanym na folii przezroczystej.

Usuń folię przezroczystą, aby ponownie zobrazować struktury powiększone ośmiokrotnie. Otwórz wybrany stos obrazów zebranej podczas poprzedniej sesji obrazowania. Odrysuj strukturę na folii przezroczystej przymocowanej do ekranu komputera.

Przybliż obraz na żywo ośmiokrotnie i wyrównaj go z przezroczystością. W zależności od dokładności wyrównania przy niskim powiększeniu, może być konieczne również niewielkie skorygowanie kąta obrazu. Ustaw współrzędne panoramy zgodnie z parametrami obrazowania z pierwszego dnia, w tym wielkość kroku i liczbę obrazów do zebrania w stosie Z. Ponowne obrazowanie można przeprowadzić maksymalnie dwukrotnie. Liczba otwarć skóry głowy powinna być ograniczona, aby uniknąć naruszenia integralności czaszki, co skutkowałoby niską rozdzielczością obrazowania u myszy wykazujących ekspresję GFP.

Podzbiór komórek parametalnych warstwy piątej oraz odpowiadające im wypustki dendrytyczne zostały zwizualizowane przy użyciu dwufotonowej laserowej mikroskopii skaningowej in vivo; tutaj przedstawiono dendryty kory wzrokowej znakowane GFP. Obraz ten jest projekcją pojedynczych obrazów uzyskanych co 5 µm od PIA do końcowej głębokości 175 µm. Obszar zaznaczony ramką pokazano tutaj w większym powiększeniu w dniu zerowym, a następnie w dniu czwartym, porównując obrazy gałązki dendrytycznej w większym powiększeniu z dnia zerowego i czwartego.

Obrazy te przedstawiają stabilne kolce wskazane białymi grotami strzałek, zanikające i cofające się kolce zaznaczone czerwonymi grotami strzałek oraz nowe kolce wskazane zielonymi grotami strzałek. Przedstawiliśmy właśnie sposób wykonywania chronicznego obrazowania dwufotonowego w korze wzrokowej myszy z wykorzystaniem preparacji cienkiej czaszki. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby zachować szczególną ostrożność w procesie ścieńczania, aby uniknąć uszkodzenia czaszki i leżącej pod nią opony twardej, ponieważ spowoduje to niską rozdzielczość obrazowania; należy również prowadzić szczegółowe notatki.

To wszystko. Dziękujemy za uwagę i życzymy powodzenia w przeprowadzeniu eksperymentów.