Obrazowanie różnicowe struktur biologicznych z wykorzystaniem dwustrojonego koherentnego antystokesowego rozpraszania Ramanowskiego (CARS)

W niniejszym filmie zaprezentowano procedurę obrazowania różnicowego dwóch rezonansów ramen związanych ze strukturami biologicznymi wykazującymi koherentne sygnały rozpraszania ramen. W pierwszej kolejności trzy zsynchronizowane lasery krótkopulsacyjne są nakładane w czasie i przestrzeni. Następnie nałożone impulsy są kierowane do standardowego mikroskopu odwróconego, co umożliwia generowanie koherentnych sygnałów ramen z obiektów mikroskopowych.

Sygnały są konwertowane na obrazy przy użyciu komercyjnego oprogramowania w celu porównania różnych generowanych sygnałów ramanowskich. Wyniki wskazują, że różnica między obrazami uzyskanymi z podwójnie i pojedynczo rezonansowych sygnałów ramanowskich zapewnia zwiększoną czułość w przypadku słabych sygnałów ramanowskich. Cześć, jestem Tyler Weeks z Centrum Biofotoniki na Uniwersytecie Kalifornijskim w Davis.

Nazywam się Thomas ER z Centrum Biofotoniki oraz Katedry Chorób Wewnętrznych na Uniwersytecie Kalifornijskim w Davis. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę wykorzystania dwustronnie rezonansowego koherentnego rozpraszania Ramanowskiego anty-Stokesa (CARS) do tworzenia obrazów komórek o specyficzności chemicznej. Stosujemy tę procedurę w celu wykrywania sygnałów z cząsteczek, które są zbyt słabe, aby można je było wykryć bezpośrednio za pomocą samej koherentnej spektroskopii Ramanowskiej anty-Stokesa.

Zacznijmy zatem. W celu jednoczesnego generowania sygnałów CARS i Dr CARS wymagane są trzy strojne i zsynchronizowane krótkopulsowe źródła laserowe. Aby uzyskać te zsynchronizowane impulsy, należy rozpocząć od pojedynczego lasera krótkopulsowego o mocy wyjściowej 10 W, stałej długości fali 1064 nm, stałym czasie trwania impulsu 7 ps oraz stałej częstotliwości repetycji 76 MHz.

Za pomocą serii półfalowych płytek kwartowych oraz polaryzacyjnych kostek dzielących wiązkę, wiązka zostaje rozdzielona na trzy części. Płytka półfalowa w połączeniu z polaryzacyjną kostką dzielącą pozwala na regulację mocy każdej z komponentów wiązki bez zmiany jej kierunku. Zazwyczaj dwie wiązki są regulowane do mocy około 4.5 W każda, a trzecia wiązka zawiera pozostały 1 W.

Dwie wiązki o wysokiej mocy są następnie kierowane do dwóch niezależnych optycznych oscylatorów parametrycznych (OPO). OPO wykorzystują proces generowania częstotliwości do przekształcenia fotonu o wysokiej energii w dwa fotony o niższej energii o różnych długościach fal. Poprzez kontrolę temperatury kryształu służącego do uzyskania tego efektu, długości fal otrzymanych fotonów mogą być kontrolowane z dokładnością do 0,1 nanometrów.

Poprzez podwojenie częstotliwości tych sygnałów, laser o stałej długości fali 1064 nanometrów może zostać przekształcony w wiązkę laserową, której długość fali można dostrajać w zakresie od 780 nanometrów do 910 nanometrów, poprzez pompowanie dwóch oddzielnych OPO tym samym źródłem 1064 nanometrów. W ten sposób otrzymuje się dwa niezależnie strojone źródła laserowe, które są automatycznie zsynchronizowane z oryginalnym laserem pompowym. Trzecia wiązka z lasera pompowego 1064 nanometrów jest kierowana wokół OPO za pomocą kombinacji luster dielektrycznych, tak aby wszystkie trzy wiązki mogły zostać później ponownie połączone.

Aby efektywnie generować koherentne fotony sygnału ramen, zrekonstruowane impulsy muszą nakładać się zarówno czasowo, jak i przestrzennie, ponieważ OPO zawierają wnęki pierścieniowe umożliwiające każdemu impulsowi laserowemu wielokrotne przejście przez kryształ; wiązka przesyłana przez OPO pokonuje dodatkową odległość, co skutkuje znacznym opóźnieniem w stosunku do pierwotnej wiązki pompy. Odległość tę należy skompensować za pomocą trzeciej wiązki poprzez wprowadzenie dodatkowych luster, które wymuszają przebycie przez nią takiej samej drogi jak przez dwie pozostałe przed ich połączeniem za pomocą luster dichroicznych, co pozwala na precyzyjną regulację długości ścieżki. Każda wiązka jest kierowana przez regulowane stopnie opóźniające, które umożliwiają dostrojenie czasowego nakładania się poszczególnych impulsów laserowych.

Do każdej wiązki dodaje się kolejny zestaw płytek półfalowych i polaryzacyjnych kostek dzielących wiązkę, aby umożliwić niezależną regulację mocy lasera dla każdej z nich. Do wstępnego połączenia wiązek z dwóch OPO, a następnie z wiązką o długości 1064 nanometrów, wykorzystuje się lustra dichroiczne; należy przy tym zadbać o precyzyjne pokrycie się wiązek w przestrzeni. Można to zweryfikować, porównując stopień pokrycia wiązek w odległości kilku centymetrów od lustra dichroicznego z ich pokryciem w odległości około jednego metra od tego lustra.

Ponieważ ekspozycja na wiązki laserowe o wysokiej mocy średniej może uszkodzić próbkę, trzy połączone wiązki są kierowane przez elektrooptyczny modulator działający jako selektor impulsów, który umożliwia regulację częstotliwości powtarzania impulsów docierających do próbki, a tym samym kontrolę mocy średniej. Połączone wiązki laserowe są następnie wprowadzane do mikroskopu odwróconego z obiektywem o wysokiej aperturze numerycznej lub na. Silna ogniskowość generowana przez obiektyw o wysokim NA umożliwia najefektywniejsze generowanie koherentnych sygnałów ramen w skalach mikroskopowych.

Obiektyw mikroskopu jest zamontowany na piezoelektrycznym stole X, Y, Z, co umożliwia uzyskiwanie obrazów poprzez rastrowanie wiązek po próbce, podobnie jak w komercyjnych konfokalnych mikroskopach skanujących. Przejdźmy teraz do sposobu generowania sygnałów CARS i DRFWM. Oddziaływanie trzech krótkich impulsów wiązek laserowych w próbce prowadzi do powstania kilku sygnałów mieszania czterofalowego, takich jak CARS z różnych kombinacji dwóch laserów, a także sygnałów trójkolorowych CARS i DR CARS z kombinacji wszystkich trzech laserów. Gdy sygnały mają zbliżoną długość fali, ich oddzielenie w celu przeprowadzenia analizy może być utrudnione.

Z tego powodu sygnały są przekazywane do spektrometru obrazującego, który służy również jako monochromator lub filtr pasmowy w celu przestrzennego rozdzielenia sygnałów o różnych długościach fal. Elektronicznie sterowane lustro odchylające wewnątrz spektrometru w pozycji opuszczonej kieruje sygnał do kamery CCD (charge coupled device) z głębokim ubytkiem nośników i podświetleniem tylnym, która dostarcza informacji spektroskopowych w całym zakresie sygnału oraz pozwala na identyfikację i optymalizację różnych spójnych sygnałów robin w celu wybrania sygnału do obrazowania. Wystarczy obrócić siatkę wewnątrz spektrometru, korzystając z dostarczonego przez producenta oprogramowania sterującego i akwizycji danych, aby wycentrować interesujący nas pik na kamerze CCD.

Następnie zmień położenie lustra odchylającego, aby przekierować sygnał do drugiego portu wyjściowego, do którego podłączona jest lawinowa fotodioda zliczająca pojedyncze fotony (APD) lub fotodioda (PD). Wykonaj skanowanie rastrowe obiektywu, a następnie wykorzystaj sygnały zarejestrowane na APD do wygenerowania obrazu poprzez wyświetlenie szybkości zliczania fotonów dla każdego piksela za pomocą oprogramowania do akwizycji danych. Powtórz tę procedurę obrazowania dla każdego pożądanego spójnego sygnału ramen, aby umożliwić porównanie sygnałów podczas postprocesingu.

Przejdźmy teraz do omówienia prawidłowego przygotowania próbki w celu uzyskania wyraźnych i powtarzalnych obrazów. Przygotowanie próbek wymaga zachowania pewnej staranności. Próbki przygotowuje się zazwyczaj na szklanych lamellkach o grubości około 150 micron.

Szkiełka zakrywkowe te są wystarczająco cienkie, aby umożliwić obrazowanie o wysokiej rozdzielczości z użyciem obiektywów imersyjnych wodnych lub olejowych o wysokiej aperturze numerycznej (NA), które są wykorzystywane w tych eksperymentach. Aby zademonstrować przygotowanie typowej próbki, przygotowujemy przekroje tkanki mięśniowej myszy o grubości około 20 μm, które są przymocowane do szkiełka przedmiotowego. Do próbki dodaje się 20 µL kropli 5 M roztworu glukozy deuterowanej.

Roztwór glukozy deuterowanej zapewnia unikalny i silny sygnał tła ramanowskiego. Na wierzchu próbki umieszcza się szklaną lamellkę, którą następnie utrwala się lakierem do paznokci w przypadku komórek i hodowli. Można stosować naczynia hodowlane z szklanym dnem, które umożliwiają obrazowanie bez konieczności odrywania komórek od naczyń wzrostowych.

Przejdźmy teraz do ustalenia odpowiednich linii Ramanowskich i pików dla tej konfiguracji. Aby w pełni wykorzystać efekt wzmocnienia podwójnego rezonansu, należy znać widma Ramanowskie obu substancji rezonansowych. Typowo są to 2845 cm⁻¹ przypisane lipidom oraz 2121 cm⁻¹ dla modu rozciągającego CD związanego z deuterowaną glukozą.

Koherentne rozpraszanie Ramana uzyskuje się, gdy różnica częstotliwości między dwoma laserami odpowiada częstotliwości drgań cząsteczkowych. Poprzez nastrojenie jednego OPO do 817 nanometrów, w połączeniu z wiązką lasera o długości 1064 nanometrów, będzie on badać mod C o częstotliwości 2 845 cm⁻¹, a nastrojenie drugiego OPO do 868 nanometrów pozwoli na badanie częstotliwości 2 121 cm⁻¹ w połączeniu z wiązką 1064 nanometrów. W trybie spektroskopowym mikroskop CARS umożliwia obserwację trzech interesujących sygnałów CARS: sygnału CARS badającego drgania rozciągające CH, sygnału CARS badającego mod rozciągający CD oraz sygnału DR CARS badającego oba powyższe; na przedstawionym schemacie przerywane strzałki oznaczają fotony z lasera w OPO, a strzałki ciągłe oznaczają wynikający z nich sygnał.

Pełne poziome linie wskazują energię wibracji ramanowskiej i stanowią wizualną reprezentację tego, że w przypadku DR carów mieszanie tych samych trzech fotonów wejściowych pozwala na jednoczesne badanie dwóch różnych wibracji ramanowskich. Natężenie sygnału dla każdego piku będzie wymagało optymalizacji poprzez dostrajanie w małych krokach wokół lokalizacji tych pików. Tutaj wybieramy każdy pik i wykonujemy obrazy nicieni morskich w roztworze glukozy o obniżonym stężeniu; wyodrębnienie dodatkowych informacji na podstawie tych trzech obrazów uzyskanych indywidualnie wymaga dość prostego przetwarzania obrazów.

W pierwszej kolejności należy znormalizować obrazy. Praktyczna metoda normalizacji opiera się na fakcie, że lipidy są hydrofobowe. Oznacza to, że w obszarach o wysokiej gęstości lipidów rezonans CD glukozy powinien w niewielkim stopniu przyczyniać się do sygnału podwójnego rezonansu.

Z drugiej strony, w obszarach czystego roztworu glukozy rezonanse CH z lipidów również powinny wnosić bardzo niewielki wkład. Mając to na uwadze, znormalizuj obraz DR car oraz obraz car uzyskany przy rezonansie CD roztworu glukozy deuterowanej do obszaru znajdującego się wyraźnie poza robakiem CL egan, który nie powinien wykazywać rezonansu CH. Następnie zidentyfikuj w obrazie car rezonansu CH obszar w obrębie robaka, który jest bogaty w lipidy, i znormalizuj go do odpowiadającego mu obszaru w znormalizowanym obrazie DR car.

Aby ta metoda działała prawidłowo, należy przyjąć, że w głębi tego obszaru nie występuje glukoza deuterowana. Jest to założenie bezpieczne, ponieważ lipidy są hydrofobowe i nie zmieszają się z roztworem. Teraz, poprzez odjęcie znormalizowanego obrazu car dla rezonansu CH od znormalizowanego obrazu car dla rezonansu DR, pozostaje jedynie wzmocniony sygnał rezonansowy CD; analogicznie postępując, odejmuje się znormalizowany obraz car dla rezonansu CD od znormalizowanego obrazu Dr.FWM.

Pozostaje jedynie wzmocniony sygnał rezonansowy CH. Przedstawione tutaj jest widmo ramen zmodyfikowanego kwasu oleinowego zawierającego modyfikację alkinową; silne rezonanse CH przy 2 845 cm⁻¹ oraz rezonans alkinowy przy 2 121 cm⁻¹ są dobrze odizolowane od regionu odcisków palców, czyli obszaru gęsto rozmieszczonych pików, co czyni je idealnymi markerami dla obrazowania koherentnego ramen. Jest to typowe widmo sygnałów koherentnego ramen generowanych, gdy trzy krótkie impulsy laserowe nakładają się w próbce. Strzałki wskazują procesy odpowiedzialne za każdy sygnał, przedstawione na schematach energetycznych.

Są to typowe wyniki obrazowania nicieni C. Elgina z wykorzystaniem CAR i DR CAR. W górnym rzędzie wykorzystano trzy przedstawione właśnie sygnały do obrazowania nicienia w roztworze glukozy o obniżonym stężeniu. W drugim rzędzie obrazy zostały odpowiednio znormalizowane, a w trzecim rzędzie powstały obrazy różnicowe poprzez odjęcie każdego z obrazów CAR od obrazu DR CAR. Właśnie zaprezentowaliśmy sposób wykonywania obrazowania różnicowego Ramana w oparciu o dwukrotnie rezonansową koherentną spektroskopię anty Stokesa.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że ważne jest upewnienie się, iż wiązki nakładają się na siebie i są odpowiednio zsynchronizowane. Ponadto podczas przełączania między różnymi sygnałami koherentnymi należy uważać, aby nie potrącić ani nie przesunąć próbki, ponieważ wpłynie to na analizę. To wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.