Wielokolorowe obrazowanie poklatkowe transgenicznych rybek zebrafish: wizualizacja komórek macierzystych siatkówki aktywowanych przez ukierunkowaną ablację komórek neuronalnych

Ekspresja fluorescencyjnych reporterów u zwierząt transgenicznych umożliwia śledzenie odpowiedzi komórkowych na manipulacje eksperymentalne w żywych modelach chorób. W niniejszej pracy u rybek zebrafish farmakologicznie indukuje się selektywną utratę komórek, a następnie wykonuje wielokolorowe obrazowanie konfokalne o wysokiej rozdzielczości. Obrazy komórek docelowych oraz ich bezpośrednich sąsiadów są pozyskiwane bezpośrednio przed i po podaniu leku, a także w określonych odstępach czasu po jego zastosowaniu. Analiza obrazów wykazuje aktywację endogennych populacji komórek macierzystych i następujące po niej zastąpienie komórek docelowych w fazie regeneracji.

Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biologii regeneracyjnej, takie jak: jakie są komórkowe i molekularne mechanizmy wykorzystywane do regeneracji poszczególnych typów komórek. Rozpocznij od przeniesienia jaj transgenicznich zebranych z kopulacji do szalki Petriego zawierającej 0,3 x danio solution w 16 godzinach po zapłodnieniu. Dodaj PTU, aby zahamować aktywność tyrozynazy przed pojawieniem się jakichkolwiek oznak pigmentacji w badanej tkance. Jeśli embrion nie jest albinosem, inkubuj embriony w temperaturze 28,5 °C.

Gdy reportery staną się widoczne, należy umieścić szalkę Petriego pod fluorescencyjnym stereomikroskopem i wyselekcjonować osobniki z pożądaną ekspresją transgenu. Przed obrazowaniem należy przygotować 0,5% roztwór montażowy aeros low melt w medium do embrionów i przechowywać go w temperaturze 40 °C.

W razie potrzeby dodać trica i PTU. Delikatnie wymieszać i powrócić do temperatury 40°C. Znieczulić ryby, umieszczając je w medium do embrionów zawierającym trica.

Przez około trzy minuty ryby będą nieaktywne. Aby przenieść ryby za pomocą mikropipety, należy pobrać pojedyncze osobniki do przyciętego końcówki pipety w objętości około 30 µL roztworu anestetyka. Następnie należy odwrócić pipetę i pozwolić rybom opaść na dno.

Dotknąć końcówki roztworu montującego i pozwolić mu przenieść się pod wpływem grawitacji. Należy uważać, aby nie rozcieńczyć agaru, tak aby można go było ponownie wykorzystać. Pozostały roztwór anestetyka z mikropipety należy odrzucić.

Następnie, używając tej samej końcówki, przenieś rybę do szalki Petriego. W około 30 µl medium montażowego delikatnie ustaw rybę tak, aby obszar zainteresowania znajdował się w centrum kropli aeros. Upewnij się, że ryba pozostaje w pożądanej orientacji aż do momentu zastygnięcia aeros.

Jeśli jest taka potrzeba, w jednej szalce Petriego można zamontować wiele ryb. Po zastygnięciu aerosu przenieś ryby na stolik mikroskopu konfokalnego i ostrożnie dolej do szalki medium dla embrionów zawierającego trica plus lub minus PTU, aż ryby zostaną całkowicie zanurzone. Otwórz oprogramowanie do obrazowania i ustaw ostrość na obszarze zainteresowania, aby uzyskać optymalny obraz szczegółów komórkowych i/lub molekularnych.

W oprogramowaniu należy użyć obiektywów o dużej odległości roboczej i wysokiej aperturze numerycznej. Z listy rozwijanej należy wybrać odpowiednie filtry fluorochromowe. Kliknij ustawienia widma i dostosuj zakresy emisji.

Aby uzyskać czystą separację sygnałów reporterowych i zmaksymalizować stosunek sygnału do szumu, należy wybrać odpowiedni obiektyw z menu rozwijanego, aby upewnić się, że wszelkie zdefiniowane programowo ustawienia wstępne zostały prawidłowo dostosowane. W celu ustawienia ostrości laserów i poziomów mocy, wybierz z tabeli wyszukiwania wyjście, które wykazuje saturację pikseli dla każdego kanału.

Następnie należy ustawić czułość detektora, aby uzyskać pożądaną jakość obrazu, stopniowo zwiększając moc lasera, aż natężenie obrazu będzie odpowiednie. Należy unikać nasycenia pikseli w obszarze zainteresowania i utrzymywać poziomy mocy lasera tak nisko, jak to możliwe, aby ograniczyć problemy związane z fotobleachingiem i fototoksycznością.

Należy upewnić się, że każda linia lasera generuje wykrywalny sygnał tylko w odpowiednim kanale, ręcznie włączając i wyłączając lasery podczas monitorowania wszystkich kanałów obrazowania. Jeśli nie stwierdzono przesłuchów, wszystkie kanały mogą być rejestrowane jednocześnie. Następnie, korzystając z funkcji zoomu i rotacji, należy wykadrować obszar zainteresowania.

Następnie ustaw prędkość skanowania i rozmiar obrazu; zastosowanie większych prędkości skanowania minimalizuje czas przebywania lasera i zwiększa rozdzielczość czasową. Ustaw wielkość kroku w wymiarze Z zgodnie z potrzebami eksperymentalnymi. W tym przypadku zastosowano krok o wielkości 10 mikronów w celu obrazowania siedmiu przekrojów optycznych tkanki siatkówki.

Po ustaleniu odpowiednich ustawień należy pozyskać obrazy Zack i zapisać je. Następnie należy przejść do kolejnej ryby. Obrazowanie w systemie seryjnego odłowu i wypuszczenia może być przeprowadzone w celu śledzenia zmian komórkowych w kolejnych dniach, zgodnie z instrukcjami zawartymi w dołączonym dokumencie pisemnym.

Podczas przeprowadzania eksperymentu z obrazowaniem wielu reporterów najlepiej jest stosować fluorofory dobrze odseparowane spektralnie, jednak nie zawsze jest to praktyczne. Przedstawiamy tutaj prostą metodę odejmowania obrazów z wykorzystaniem oprogramowania open source ImageJ, aby rozdzielić fluorofory o nakładających się profilach wzbudzenia i emisji. W naszym przypadku są to GFP i YFP.

Techniki obrazowania w czasie rzeczywistym opisane w tym filmie zostały wykorzystane do monitorowania komórek macierzystych siatkówki znakowanych białkiem GFP podczas ablacji i regeneracji neuronów bipolarnych siatkówki. Aby przeprowadzić separację spektralną, należy zarejestrować obrazy w trybach obrazowania sekwencyjnego i przy zmiennych ustawieniach filtrów barierowych, co pozwala na niezależne pozyskiwanie nakładających się fluoroforów i ich częściową separację. Po zarejestrowaniu obrazów należy użyć wtyczki importu plików loci bio w programie ImageJ, aby otworzyć pliki obrazów i uruchomić narzędzie importu. Następnie należy przeciągnąć wybrany plik do okna programu ImageJ.

Podziel kanały na poszczególne stosy, zaznaczając pole wyboru „split channels” w oknie importu podczas uruchamiania wtyczki „align three TP”. Kliknij „plugins”, następnie „align stacks”, a potem „align three tp”.

Stosy muszą zostać wyrównane, aby zapewnić prawidłowe odejmowanie. W pierwszym polu rozwijanym wybierz stos referencyjny, a w drugim stos niewyrównany. Zaznacz pola use XY relative origin oraz use Z relative origin, a następnie kliknij okay.

Aby rozpocząć proces dopasowania, kliknij przycisk rejestracji wolumetrycznej. Pojawi się nowe okno zawierające parametry dopasowania. Kliknij OK.

Ta sekcja została zoptymalizowana przez dystrybutora wtyczki, zatem nie są wymagane żadne modyfikacje. Po zakończeniu pojawi się okno z wyrównanymi stosami. Wybierz wynik z wyrównanego okna, aby otworzyć okno wyjściowe.

To okno jest również zoptymalizowane i nie wymaga modyfikacji. Kliknij OK. W obszarze roboczym pojawi się nowy stos, a do tytułu pliku zostanie dopisane słowo aligned.

Aby usunąć przesłuchy (crosstalk) za pomocą kalkulatora obrazów, kliknij proces, a następnie kalkulator obrazów. W rozwijanym polu obraz jeden wybierz stos obrazów, z którego ma zostać wykonane odjęcie, oraz stos obrazów wykorzystywany do odejmowania. W rozwijanym polu obraz dwa wybierz odejmowanie w polu operacji, a następnie kliknij OK.

Program ImageJ zapyta o przetworzenie stosu. Wybierz tak. Powinien pojawić się nowy stos, w którym usunięto przesłuchy między nakładającymi się kanałami.

Połącz stosy, aby odtworzyć tę samą strukturę obrazu sprzed wyrównania i odejmowania. Poprzez wybranie połączonych kanałów w oknie narzędzi kanałów, narzędzie to umożliwia połączenie do czterech stosów w tzw. hyperstack. Na koniec nadaj kanałom kolory, dostosuj jasność oraz kontrast i zapisz pliki w formacie tiff, aby zbadać ukierunkowaną utratę i regenerację nitroreduktazy.

Retinalne komórki bipolarne wykazujące ekspresję M cherry. Seria obrazów konfokalnych została wykonana w poszczególnych osobnikach danio pręgowanego przed rozpoczęciem zabiegu. Widoczna jest mozaikowa ekspresja reportera YFP z markerem błonowym w kontrolowanych komórkach bipolarnych (kolor żółty) oraz białka fuzyjnego nitroreduktazy z cherry w komórkach bipolarnych docelowych (kolor czerwony).

Transgen CFP znakujący błonę, widoczny w kolorze cyjanowym, dostarcza informacji kontekstowych na temat większości pozostałych komórek siatkówki dla zwiększenia przejrzystości. To samo zdjęcie bez sygnału CFP przedstawiono po zastosowaniu metronidazolu. Czerwone komórki dwubiegunowe wykazujące ekspresję nitroreduktazy ulegają zanikowi, podczas gdy żółte komórki dwubiegunowe kontrolne zostają oszczędzone.

Obrazuje to wysoką specyficzność tej metody ablacji. Ponownie, dla przejrzystości przedstawiono ten sam obraz bez CFP. Po usunięciu metro NIAZ, w tym miejscu powracają komórki wykazujące ekspresję NTR.

Przykład metody odejmowania G-F-P-Y-F-P przedstawiono na tej rycinie: komórki Muellera znakowane GFP. Komórki glejowe są zaznaczone na zielono, a bipolarne komórki znakowane YFP na fioletowo. Nakładanie się obu barwników daje kolor biały, co umożliwia wykonanie odejmowania.

Obrazy GFP i YFP muszą zostać najpierw wyrównane. Proces odejmowania pozwala następnie na usunięcie komórek dwubiegunowych znakowanych YFP z obrazu GFP, co umożliwia przejrzystą reprezentację komórek Müllera znakowanych GFP oraz wykrycie słabiej świecących komórek Müllera. Można teraz zweryfikować nakładanie się słabo świecących komórek Müllera oraz komórek dwubiegunowych znakowanych M cherry, przedstawionych na czerwono.

Przedstawione tutaj dane sugerują, że ablacja komórek bipolarnych wyzwala komórki glejowe Müllera do zastąpienia utraconych komórek. Interpretacja ta jest zgodna z niedawnymi badaniami nad regeneracją siatkówki, które wskazują na komórki glejowe Müllera jako indukowane urazem komórki progenitorowe zarówno u ssaków, jak i ryb. Technika ta pozwala badaczom badać mechanizmy regulujące regenerację specyficznych typów komórek poprzez wizualizację komórek macierzystych u danio pręgowanego.