Metoda izolacji wysepek mysich i przeszczepiania podtorebkowego do nerki

Transplantacja wysepek została zaproponowana jako potencjalna metoda leczenia cukrzycy typu pierwszego. Istnieją jednak dwa główne ograniczenia, które uniemożliwiają jej powszechne zastosowanie w praktyce klinicznej. Po pierwsze, dla każdego biorcy wymagana jest duża liczba wysepek.

Ponieważ wysepki są pozyskiwane od dawców organów, liczba potencjalnych biorców jest bardzo ograniczona. Ponowna transplantacja wymaga dożywotniego leczenia silnymi immunosupresantami, co naraża pacjentów, a w szczególności populację pediatryczną, na ryzyko wystąpienia nowotworów, infekcji oraz niewydolności nerek. Transplantację wysepek pod torebkę nerki myszy przeprowadza się w celu zbadania strategii poprawiających wyniki kliniczne przeszczepiania.

Wysepki wyizolowane od zdrowych myszy dawców podzielono na grupy i przygotowano do transplantacji. Następnie wysepki zostają przeszczepione do przestrzeni podtorebkowej nerki. W myszach biorcach z cukrzycą funkcję przeszczepu wysepek ocenia się poprzez monitorowanie poziomu glukozy we krwi, co wykazuje, że około 250 do 350 wysepek przywraca glikemię u myszy biorcy o masie 20 gram w ciągu 24 godzin od transplantacji.

Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa w odniesieniu do etapów kaniulacji. Kaniulacja wspólnego przewodu żółciowego oraz przeniesienie oczek do przestrzeni podtorebkowej nerki są trudne do opanowania. Kroki te wymagają identyfikacji struktur tkankowych, pewnych rąk oraz zastosowania techniki minimalizującej uszkodzenia tkanek.

Uśpioną mysz ułóż w pozycji grzbietowej na ręczniku papierowym pod stereomikroskopem i spryskaj brzuch 70% ethanolem. Za pomocą nożyczek otwórz jamę brzuszną, wykonując nacięcie w kształcie litery V od okolic łonowych w kierunku obu przednich kończyn. Mysz znajduje się pod stereomikroskopem.

Ustaw go tak, aby głowa była skierowana w stronę obserwatora. Zlokalizuj wejście wspólnego przewodu żółciowego do dwunastnicy za pomocą kleszczyków hemostatycznych, czyli ujście wspólnego przewodu żółciowego do dwunastnicy. Kleszczyki powinny być ustawione tak, aby po zaciśnięciu biegły dokładnie wzdłuż granicy między trzustnicą a jelitem.

Zostaną zaprezentowane dwie metody kaniulacji przewodu żółciowego: metoda wolnej ręki oraz metoda z wykorzystaniem pęsety. Stosując metodę wolnej ręki, odciągnij zacisk hemostatyczny założony na dwunastnicę od głowy myszy w stronę ogona, tak aby wspólny przewód żółciowy został napięty.

W pobliżu wątroby znajduje się zbieżność w przewodzie żółciowym, gdzie łączą się żółć odpływająca z pęcherzyka żółciowego oraz enzymy z wątroby. Przed wprowadzeniem do jelit naciągnij przewód żółciowy, aby odsłonić wnętrze miejsca rozwidlenia w kształcie litery V. Użyj zgiętej igły 27 G dołączonej do strzykawki o pojemności 5 mL w taki sposób, aby igła przesunęła się przez to rozwidlenie i bezpośrednio kaniulowała dolną część przewodu. Wsuń igłę o kilka milimetrów poza koniec ścięcia, aby zapobiec cofaniu się treści do wątroby i pęcherzyka żółciowego.

Po pomyślnym przeprowadzeniu kaniulacji należy przepłukać trzustkę, podając dwa mililitry liazy za pomocą strzykawki. Jako wskaźnik optymalnej kaniulacji należy obserwować powiększenie trzustki nad żołądkiem. Alternatywnie można przeprowadzić kaniulację przewodu żółciowego.

Stosując metodę cysty kleszczykowej, odciągnij zacisk hemostatyczny C zaciśnięty na dwunastnicy od strony głowy myszy w kierunku ogona, tak aby wspólny przewód żółciowy stał się napięty. Następnie, używając zgiętej igły 27 G przymocowanej do strzykawki 5 ml, przebij powięź poniżej wspólnego przewodu żółciowego w pobliżu wątroby.

Przy pozostawieniu igły w miejscu, użyj jej do oddzielenia powięzi od przewodu. Odłóż kleszczyki hemostatyczne i chwyć pęsetę. Używając jednego ramienia otwartej pęsety, podtrzymaj przewód żółciowy w miejscu, w którym igła oddzieliła powięź, jednocześnie przesuwając przewód i pęsetę do przodu.

Wsuń igłę do przewodu, używając pęsety jako punktu podparcia. Prawidłowe przeprowadzenie kaniulacji objawia się równomiernym rozszerzeniem obszaru trzustki nad żołądkiem. Po uprzednim przepłukaniu trzustki usuń kleszczyki hemostatyczne z dwunastnicy.

Następnie za pomocą pęsety unieś dwunastnicę i użyj drugiej pęsety, aby oddzielić trzustkę od jelit. Następnie odsuń trzustkę od górnej części żołądka i śledziony. Na koniec wyjmij trzustkę z jamy brzusznej i odetnij ją od pozostałych połączeń powięziowych z jelitem, żołądkiem i śledzioną.

Umieść trzustkę w probówce stożkowej o pojemności 50 ml i pozostaw ją na lodzie. Inkubuj trzustkę w temperaturze 37 °C zgodnie z instrukcjami zawartymi w towarzyszącym protokole pisemnym. Po inkubacji dodaj do probówek 20 ml pożywki i rozdrób tkankę, energicznie wstrząsając probówkami 40 razy w ciągu 10 sekund.

Ten etap jest kluczowy dla optymalnego odzysku fiołków. Wiruj komórki z prędkością 800 obrotów na minutę. Resuspenduj w 15 mililitrach pożywki i skondensuj próbki.

Przelej resuspenderowaną zawiesinę przez sito z drutu o oczkach 0,419 mm i przelej ją do nowej probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Przepłucz pierwszą probówkę dodatkowymi 10 ml pożywki zawierającej 10% fetal bovine serum i przelej ją przez sito. Skoncentruj komórki poprzez wirowanie, a następnie resuspenderuj osad w 5 ml OptiPrep 1077 w temperaturze pokojowej. Wymieszaj delikatnie w wirówce typu vortex przez kilka sekund, dodaj kolejne 5 ml OptiPrep, rozprowadzając go po ściankach probówki, aby zmyć osad komórkowy ze ścianek. Powoli nanieś pipetą 10 ml bezsurowiczego RPMI po ściance probówki z prędkością 1 ml na 10 sekund.

Powinna być widoczna wyraźna granica faz. Następnie próbki należy wirować w wirówce z ruchomymi koszyczkami w temperaturze 20 °C przy 900 ×g przez 20 minut, z bardzo wolnym przyspieszeniem i bez hamowania po zakończeniu wirowania; wyspy zostaną oddzielone od komórek egzokrynnych za pomocą jednorazowej pipety serologicznej o pojemności 10 mL. Przenieść wyspy z granicy faz medium histo Paque do nowej probówki stożkowej o pojemności 50 mL.

W tym momencie można połączyć kilka probówek, aby usunąć pozostałości wyspecjalizowanych struktur, wypełnić probówki pożywką zawierającą serum i odwirować wyspki, wirując probówki przez dwie minuty przy 800 obrotach na minutę. Następnie ponownie zawiesić wyspki w świeżej pożywce. Powtórzyć ten krok co najmniej dwa razy.

Resuspender osad w pięciu mililitrach pożywki. Umieścić nylonowy sitko do komórek o oczkach 0,1 mm dnem do góry na stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Przenieść pipetą resuspensję komórek przez sitko, aby zebrać eyelety.

Następnie opłucz probówkę o pojemności 50 ml dodatkowymi sześcioma ml pożywki i przepuść ją przez sitko. Nanieś kroplę 3 ml pożywki na szalkę Petriego o średnicy 10 cm. Odwróć sitko do komórek i zanurz je w kropli pożywki, aby zebrać oczka; za pomocą pipety przepuść dodatkowe 5–7 ml pożywki hodowlanej przez sitko do szalki Petriego.

Aby zebrać pozostałe przeźrenice z sita przy użyciu obiektywu 4x, należy pojedynczo pobierać przeźrenice pipetą P 200 i przenosić je do probówki mikroodśrodkowej o pojemności 1,5 mililitra. Te obrazy przedstawiają przeźrenice wyizolowane z 12-tygodniowych myszy C 57 black six. Czystość i jakość przeźrenic można ocenić mikroskopowo po zakończeniu procedury izolacji.

Na przykład dwa przedstawione tutaj obrazy ukazują reprezentatywne pole, w którym obecne są zanieczyszczenia w postaci debris oraz komórek egzokrynnych. Podczas wyboru soczewek do eksperymentu należy unikać wybierania komórek egzokrynnych stanowiących zanieczyszczenie oraz soczewek, które wydają się niezdrowe. Soczewki z nekrotycznymi centrami są niezdrowe, co pokazano na tej rycinie wykonanej 24 godziny po izolacji; centra nekrotyczne nie będą widoczne bezpośrednio po izolacji.

Występowanie wysepek złuszczających komórki jest nieuniknione; mogą one zostać wykorzystane w transplantacji wysepek, co pokazano w tym 24-godzinnym filmie poklatkowym. Bezpośrednio po izolacji w wielu wysepkach rozwijają się centra nekrotyczne. Centra nekrotyczne te wydają się być usuwane z wysepek pod koniec nagrania podczas ich selekcji.

Pogrupuj je w taki sposób, aby w każdej probówce znajdował się równomierny rozkład jakości i rozmiaru przemiżbek. Na przykład każda grupa 15 przemiżbek może zawierać cztery duże, sześć średnich i pięć małych przemiżbek. Umieść probówkę na lodzie; przemiżbek można użyć natychmiast do transplantacji lub dalszej manipulacji.

Przed użyciem. Umieść sterylną końcówkę do nakładania żelu w otworze probówki typu microfuge o pojemności 1,5 ml w taki sposób, aby powstało delikatne wygięcie w kształcie litery U w wąskim końcu końcówki. Oba otwory końcówki powinny być skierowane bezpośrednio w górę, poza probówkę typu microfuge.

Ostrożnie wyjmij probówkę z oczkami z lodu. Upewnij się, że wszystkie oczka opadły na dno probówki. Za pomocą pipety P 200 delikatnie pobierz oczka z dna probówki, używając minimalnej objętości cieczy, i przenieś je do przygotowanego zakrzywionego końcówki.

Po osadzeniu oczek usuń jak największą ilość medium z końcówki, aspirując je przez szeroki otwór końcówki do nakładania żelu zawierającej oczka, używając nowej końcówki do nakładania żelu zamocowanej do pipety P 200. Przymocuj nieścięty koniec rurki do wąskiego otworu końcówki do nakładania żelu zawierającej oczka. Następnie zamocuj końcówkę do pipety P 200 i delikatnie wypchnij oczka do rurki.

Następnie połącz niezafazowany koniec rurki PE 50 z igłą strzykawki Hamiltona o objętości 25 µL. Przy wycofanym tłoku naciskaj tłok strzykawki, aż oczka znajdą się w odległości około 0,5 cm od zafazowanego otworu. Odstaw strzykawkę, aby oczka mogły zebrać się w jedną masę w pobliżu zafazowanego otworu rurki podczas przygotowywania nerki do przyjęcia oczek.

Przygotuj pole operacyjne, przycinając sierść i szorując skórę Betadyną naprzemiennie z 70% izopropyloalkoholem trzy razy. Rozpocznij procedurę transplantacji oczka, wykonując ucisk palca u stopy, aby potwierdzić znieczulenie u myszy biorcy. Umieść trzpień szklanej rurki bezpośrednio pod myszą i poniżej nerki, prostopadle do rdzenia kręgowego.

Następnie należy zlokalizować nerkę przez skórę i rozłożyć sterylną draperię chirurgiczną. Po zlokalizowaniu nerki użyć nożyc McFersona, aby wykonać dwucentymetrowe nacięcie przez skórę bezpośrednio nad nią, prostopadle do rdzenia kręgowego. To nacięcie odsłoni ścianę otrzewnej.

Wykonaj nacięcie o długości jednego centymetra w ścianie otrzewnej w tym samym kierunku, co nacięcie warstwy skóry, używając trzonu szklanej rurki jako podpórki; wysuń nerkę przez otwór w otrzewnej, uciskając przylegającą powierzchnię. Zwilż powierzchnię odsłoniętej nerki lodowatym, sterylnym PBS za pomocą nasączonego aplikatora z bawełnianym końcem. Powtarzaj ten krok co kilka minut w razie potrzeby, aby zapobiec wyschnięciu torebki nerki.

Używając igły o rozmiarze 27 G, wykonaj nacięcie o długości 0,2 centymetra przez torebkę nerki w poprzek jej powierzchni przedniej. Przesuwając się z lewej strony bocznej w stronę prawej strony bocznej, wprowadź szklaną rurkę kapilarną wyciąganą nad płomieniem. Przesuń ją przez wykonane wcześniej nacięcie w kierunku tylnym wzdłuż bocznej powierzchni grzbietowej nerki.

Aby utworzyć kieszeń między torebką a miąższem nerki, przesuń przelotki w przygotowanej strzykawce Hamiltona o pojemności 25 ml do samej krawędzi ściętego otworu elastycznej rurki. Następnie wprowadź rurkę ściętą krawędzią do góry do przestrzeni podtorebkowej. Długa krawędź powinna stykać się z miąższem nerki.

Przesuń rurkę do najbardziej tylnego końca torebki. Następnie powoli przenieś oczka z rurki PE 50 do przestrzeni podtorebkowej, naciskając tłok strzykawki. W miarę jak oczka wypełniają przestrzeń, powoli wycofuj elastyczną rurkę, aby zrobić więcej miejsca.

Po wyjęciu probówki z woreczka, przesuń szklaną sondę wzdłuż zewnętrznej powierzchni nerki w kierunku od przedniej do tylnej, aby delikatnie wprowadzić oczka do bliższego końca woreczka. Używając pęsety z zakrzywionym ramieniem, unieś wyściółkę otrzewnej przylegającą do otworu wykonanego dla nerki. Następnie użyj aplikatora z bawełnianym końcem nasączonego PBS, aby delikatnie przesunąć nerkę z powrotem do jamy otrzewnej.

Zamknij otwór u myszy, nakładając szwy na ścianę otrzewnej i klipsy chirurgiczne na warstwę skóry. Umieść mysz z powrotem w klatce i prowadź obserwację. W celu usprawnienia rekonwalescencji, myszy należy zapewnić wodę z octanem.

Wyizolowano wysepki z oczu myszy C. Stosując metody opisane w tym filmie, przeniesiono dawkę leczniczą do allogenicznych myszy C 57 black six. Poziomy glukozy we krwi na czczo monitorowano począwszy od pierwszego dnia po operacji.

Odrzut powinien być widoczny około 17. dnia u myszy biorców o masie 20 g, które otrzymały 300 wycinków (eyelets) od dawcy allogenicznego. Powrót do sprawności monitorowano u myszy, które otrzymały 150 lub 300 wycinków od dawców syngenicznych. W tych przeszczepach nie obserwuje się odrzutu, ponieważ wycinki pochodzą od dawców syngenicznych.

Dawka podana w formie wysepek mierzy główną funkcję wysepek bezpośrednio po transplantacji. Podczas gdy przy 150 wysepkach zaobserwowano marginalną regenerację, pełna regeneracja wystąpiła po transplantacji 300 wysepek. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać odpowiednią wiedzę na temat wykonywania kluczowych kroków niezbędnych do izolacji wysepek mysich i ich transplantacji w przestrzeń podtorebkową nerki.

Wraz z praktyką nabędziesz umiejętność szybkiego kaniulowania wspólnego przewodu żółciowego, co jest najtrudniejszym etapem niniejszego protokołu.