Analiza całogenomowa z wykorzystaniem metody ChIP w celu identyfikacji specyficznych dla izoform celów genowych

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zidentyfikowanie genomowych celów KDM5A (KDM5A), demetylazy histonowej RBB2. Jest to realizowane poprzez przygotowanie sieciowanej chromatyny, która w drugim kroku zostaje poddana sonikacji w celu uzyskania fragmentów DNA o odpowiedniej wielkości. Fragmenty DNA związane z RBB2 są następnie immunoprecypitowane za pomocą przeciwciał przeciwko RBB2.

Następnie odzyskano genomowe DNA poddaje się amplifikacji metodą PCR w celu sekwencjonowania. W końcowym etapie krótkie odczyty z sekwencjonowania Illumina są jednoznacznie dopasowywane do genomu ludzkiego, a następnie identyfikuje się istotne piki i przypisuje je do najbliższych genów. Aby zidentyfikować Rbbb dwa geny docelowe, uzyskuje się wyniki wskazujące na funkcje molekularne związane z Rrb B dwoma genami docelowymi na podstawie ogólnogenomowej identyfikacji regionów wzbogaconych w Rbbb dwa.

Cześć, jestem Mike. Pochodzę z laboratorium dr Elizabeth Bencia z Katedry Biochemii i Genetyki Molekularnej na University of Illinois w Chicago. A ja jestem Ala z laboratorium genomiki biomedycznej prowadzonego przez dr NGA w BARCEL Biomedical Research Park University PO P fea.

Jestem Danielle Dal. A ja jestem William Richter. Oboje pracujemy również w Benevolence Skill Lab.

Dzisiaj przedstawimy procedurę immunoprecypitacji i sekwencjonowania chromatyny. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania miejsc wiązania histonów. Zacznijmy zatem.

Aby rozpocząć tę procedurę, należy wyhodować około 10⁸ komórek na każdą immunoprecypitację (ip) chłoniaka osteolitycznego typu rozlanego.

Komórki U 9 37 są wykorzystywane i indukowane do różnicowania monocytarnego za pomocą TPA przez 96 godzin po wzroście komórek; do medium dodaje się bezpośrednio roztwór formaldehydu do stężenia końcowego 1%. Następnie krótko zakręć kolbą i pozostaw komórki w temperaturze pokojowej na 10 minut. Następnie odessij medium i wypłucz komórki 15 mililitrami lodowatego PBS. Powtórz to płukanie raz.

Następnie do każdej z kolb znajdujących się w lodzie należy dodać 6 ml buforu lizującego 1. Kolby należy inkubować w ruchu obrotowym przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Na koniec komórki należy zebrać za pomocą skrobaka do komórek i przenieść do stożkowych probówek o pojemności 15 ml.

Na tym etapie komórki można przechowywać w temperaturze -80 °C. Jeśli komórki zostały zamrożone, należy je rozmrozić. Po rozmrożeniu komórki należy odwirować, a nadsącz usunąć.

Następnie komórki resuspenduj w 6 ml buforu lizującego dwa i delikatnie mieszaj probówki na wytrząsarce w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Powtórz wirowanie, a następnie resuspenduj komórki w 2,5 ml buforu lizującego trzy. Następnie przygotuj zawiesinę do sonikacji, umieszczając ją w zlewce z lodowatą wodą, używając mikrokońcówki sonikatora Branson 450 z amplitudą ustawioną w zakresie od 50 do 60%.

Poddaj roztwór sonikacji w stałych seriach trwających po 32 s i chłodź na lodzie. Powtarzaj te impulsy od 10 do 15 razy w ciągu jednej minuty, a następnie pipetuj zawartość probówki w górę i w dół i przenieś ją do nowej probówki. Kontynuuj impulsową sonikację i chłodzenie roztworu.

Pięć kolejnych razy po sonikacji należy dodać 10% Triton X 100 w ilości odpowiadającej 1/10 objętości roztworu. Następnie lizaty należy przenieść do probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml i odwirować pozostałości w mikrowirówce przed przeprowadzeniem immunoprecypitacji chromatyny lub Chip. 50 µl lizatu komórkowego należy zachować jako próbkę wejściową (input).

Następnie oczyszczony lizat komórkowy połączono z kulkami dyna beads związanymi z przeciwciałem, które przygotowano wcześniej zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Mieszaninę, wraz z próbką wejściową o objętości 50 µL, inkubowano w ruchu obrotowym w temperaturze 4 °C przez noc. Kulki przemyto 1 mL buforu do płukania.

Następnie należy użyć statywu magnetycznego w celu zebrania kulek i usunąć nadsącz. Płukanie to należy powtórzyć od sześciu do ośmiu razy. Na koniec należy przeprowadzić płukanie końcowe za pomocą 1 mL buforu TE z dodatkiem 50 mM chlorku sodu.

Po wirowaniu odwiruj kuleczki w mikrocentry fudze, a następnie odessaj pozostały bufor TE. Następnie dodaj do próbek 100 µL buforu eluującego. Zrób to niezwłocznie.

Inkubować próbki w temperaturze 65 °C przez 10 do 15 minut. Co dwie minuty pocierać probówki o statyw do probótek 1,5 ml, aby utrzymać koraliki w zawiesinie. Zebrać koraliki za pomocą wirowania oraz statywu magnetycznego, a następnie przenieść SNAT do probówki PCR.

Następnie należy odzyskać wcześniej zapisaną próbkę wejściową i dodać trzy objętości buforu eluującego. Na koniec próbki IP i wejściowe należy umieścić w termocyklerze na noc w temperaturze 65 °C. Aby następnego dnia odwrócić wiązania krzyżowe, do próbek należy dodać jedną objętość buforu TE.

Następnie należy dodać RNA A do stężenia końcowego 0,2 µg/µL. Próbki należy inkubować w termocyklerze przez jedną do dwóch godzin w temperaturze 37 °C. Po inkubacji dodaje się proteinazę K do stężenia końcowego 0,2 µg/µL.

Następnie inkubuj próbki w termocyklerze w temperaturze 55 °C przez dwie godziny. Następnie poddaj próbki jednej ekstrakcji, używając jednej objętości fenolu. Przeprowadź drugą ekstrakcję próbek, używając jednej objętości mieszaniny fenol-chloroform-alkohol izoamylowy.

Na koniec ponownie wyekstrahuj próbki, używając jednej objętości chloroformu z alkoholem izoamylowym. Następnie do każdej próbki dodaj 30 µg glikogenu. Dodaj również chlorek sodu do stężenia końcowego 0,2 M oraz dwie objętości etanolu do próbek.

Inkubować je przez 30 minut w temperaturze -80 °C. Po inkubacji odwirować próbki i odlać nadsącz. Przemyć osady 500 µL 75% etanolu, a następnie osuszyć osady i zawiesić je ponownie w 40 µL wody.

Aby sprawdzić wielkość fragmentów DNA otrzymanych w wyniku procedury SONIKACJI, należy nanieść 5 µg oczyszczonej próbki wejściowej na żel agarozowy 1,8% i przeprowadzić elektroforezę. Procedura sonikacji powinna przynieść fragmenty o długości od 150 do 350 par zasad. Jeśli jednak fragmenty nie mieszczą się w tym zakresie, należy dostosować parametry sonikacji, zmieniając liczbę impulsów oraz amplitudę przed przystąpieniem do amplifikacji DNA genomowego.

Sprawdzić wielkość, stężenie i stopień wzbogacenia próbek zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Aby rozpocząć amplifikację DNA genomowego, pobrać 34 µL próbki IP oraz 200 ng próbki wejściowej (input). Przeprowadzić dodanie ogona, naprawę oraz ligację adapterów do fragmentów DNA, korzystając z zestawu do przygotowania próbek DNA genomowego firmy Illumina, zgodnie z opisem w protokole pisemnym.

Oczyść DNA za pomocą zestawu do mini oczyszczania produktów PCR, a następnie eluuj je w buforze EB uprzednio podgrzanym do 50 °C. Użyj odpowiednio 23 µL i 46 µL dla próbek DNA IP oraz DNA wejściowego. Przygotuj reakcję PCR, używając 23 µL DNA z adapterami oraz 25 µL polimerazy DNA z zestawu.

1 µL 20 µM startera PCR 1 oraz 1 µL 20 µM startera PCR 2. Przeprowadzić reakcję PCR zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Po amplifikacji PCR oczyścić DNA za pomocą zestawu Qiagen mini loop PCR purification kit.

Podgrzej 15 µL buforu EB do 50 °C i rozcieńcz DNA, rozcieńczając 0,5 µL próbki w stosunku jeden do czterech, a następnie wykonaj pomiar za pomocą NanoDrop, aby oczyścić produkty amplifikacji. Przygotuj 50 mL 1,8% żelu AGROS, używając wody klasy HPLC; po stopieniu AGROS dodaj TAE i bromek. Następnie wlej żel do formy i załaduj próbki.

Po dodaniu czterech mikrolitrów buforu do nakładania do próbek wejściowych (input) i IP, należy przeprowadzić elektroforezę w żelu przy napięciu 120 V przez 45 minut. Następnie należy przeanalizować żel. Wyniki powinny wykazać powstanie fragmentów o długości od 150 do 350 par zasad.

Reprezentują one fragmenty genomowego DNA o długości od 50 do 250 par zasad. Następnie za pomocą skalpela wycina się z żelu obszar zawierający materiał w zakresie od 150 do 350 par zasad. Należy uważać, aby nie wyciąć prążka adaptera, który znajduje się na poziomie około 120 par zasad.

Odzyskaj DNA, korzystając z zestawu do szybkiej ekstrakcji z żelu kayak zgodnie z instrukcją producenta. Odparuj próbkę do dokładnie 11 µL w SpeedVac bez użycia ciepła. Pobierz 1 µL próbki i zmierz stężenie DNA za pomocą spektrofotometru NanoDrop.

Na koniec należy zidentyfikować wzbogacone produkty genów przy użyciu analizatora genomu Illumina oraz przeanalizować miejsca wiązania i geny docelowe zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Współrzędne genomiczne zidentyfikowanych wzbogaconych regionów wiązania białka RB dwa lub RBP dwa przedstawiono w formacie z podziałem na chromosomy. Stopień zajętości genów z bazy Ensemble w chromosomach można zwizualizować jako czarne paski VAR.

Tutaj przedstawiono obsadzenie chromosomu 10; regiony wiązania RBP2 pokazano jako linie pionowe. Środkowy panel prezentuje wszystkie regiony wiązania izoform RBP2 na chromosomie 10, a dolny panel przedstawia regiony wiązania dużej izoformy RBP2. Informacje te dają przegląd nakładającego się i specyficznego obsadzenia izoform RBP2 na chromosomie 10.

Przedstawiono mapę ciepła z kategorii funkcji molekularnej ontologii genów (GO), które wykazują istotne wzbogacenie po korekcie o współczynnik odkryć fałszywych (FDR) wśród genów związanych z rbp. Kolory przechodzące w czerwony wskazują wysoką istotność statystyczną. Kolor żółty oznacza niską istotność statystyczną, a szary brak istotności statystycznej.

Analiza wzbogacenia wykazuje nakładające się oraz specyficzne dla izoform funkcje molekularne dwóch genów docelowych R BP. Właśnie pokazaliśmy, jak zidentyfikować miejsca wiązania czynników transkrypcyjnych podczas tej procedury. Ważne jest, aby uzyskać fragmenty DNA o odpowiednim zakresie wielkości i wydajności.

Można to osiągnąć, postępując zgodnie z naszymi wytycznymi podczas etapu SONIKACJI. To wszystko. Powodzenia w eksperymentach i dziękujemy za oglądanie.