Podawanie rotenonu drogą doustną za pomocą zgłębnika oraz analiza obrazowa inkluzji alfa-synukleiny w jelitowym układzie nerwowym

Objawy choroby Parkinsona, w tym zaburzenia motoryczne i mowy, wynikają z obniżonej aktywności komórek wydzielających dopaminę w mózgu. Przewodem pokarmowym oraz opuszka węchowa są najbardziej narażonymi strukturami nerwowymi i pierwszymi, które ulegają uszkodzeniu. Chorobę Parkinsona wiązano z ekspozycją na pestycydy.

W celu analizy wpływu pestycydów na jelitowy układ nerwowy, myszom podaje się pestycyd roone poprzez zgłębnik dożołądkowy. Następnie u myszy przeprowadza się perfuzję wewnątrzsercową 4% paraformaldehydem, aby utrwalić mózg i jelitowy układ nerwowy. Tkanka jest pobierana, preparowana i poddawana barwieniu immunocytochemicznemu w celu wykrycia białek związanych z PD.

Obrazy beta III tubuliny oraz alfa-synukleiny uzyskane za pomocą mikroskopii konfokalnej wykazują akumulację alfa-synukleiny wewnątrz neuronów jelitowego układu nerwowego u zwierząt poddanych działaniu pestycydów. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak systemiczna administracja rotenonu, jest zapewnienie, że efekt działania rotenonu jest ograniczony do jelitowego układu nerwowego. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące choroby Parkinsona, takie jak jej etiologia oraz mechanizmy leżące u podłoża jej progresji.

Zastosowanie tej techniki rozciąga się na terapię i diagnostykę choroby Parkinsona, ponieważ umożliwi ona opracowanie nowych celów terapeutycznych i metod diagnostycznych. Choć metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat patofizjologii choroby Parkinsona, można ją również zastosować w innych układach, takich jak badanie wpływu innych toksyn środowiskowych na jelitowy, współczulny i przywspółczulny układ nerwowy, a także na ścianę jelita. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ opanowanie techniki gavage wymaga czasu.

Pomysł na te metody pojawił się u mnie po raz pierwszy, gdy przeczytałem o powiązaniach między pestycydami a chorobą Parkinsona. Pomocne było również zapoznanie się z konferencją wysokich CORA podczas World Parkinson Congress w Berlinie w 2005 roku. Konieczna jest pokojowa demonstracja tej metody.

Metoda podawania ol za pomocą zgłębnika jest trudna, ponieważ myszy mają inną anatomię niż ludzie; z drugiej strony, analiza obrazu została przeprowadzona z wykorzystaniem dostosowanych kroków dla tych obrazów. Protokół należy rozpocząć od zważenia zwierzęcia. Następnie należy obliczyć odpowiednią objętość rotenonu.

Wymagane jest 0,01 mililitrów na gram masy ciała zwierzęcia, co odpowiada dawce roone wynoszącej pięć miligramów na kilogram. Napełnić strzykawkę o pojemności jednego mililitra roztworem roone, a następnie drugą strzykawkę roztworem nośnikiem. Chwycić mysz, trzymając ją za ogon jedną ręką.

Napiąć skórę szyi, odciągając ją dwoma pierwszymi palcami drugiej ręki. Po unieruchomieniu głowy między palcami, oprzeć ją o wnętrze dłoni i odwrócić do góry nogami. Unieruchomić ogon.

Używając czwartego i piątego palca, trzymając głowę odchyloną do tyłu, uciśnij podniebienie, aby otworzyć pyszczek myszy. Delikatnie wprowadź zgłębnik do pyszczka. Powoli przesuwaj zgłębnik w kierunku żołądka, aż zostanie wprowadzony w całej swojej długości.

Aby uniknąć przedostania się materiału do płuc, należy podać roztwór roone lub nośnik, delikatnie naciskając tłok. Po zakończeniu powoli wyciągnąć zgłębnik i umieścić zwierzę z powrotem w innej klatce, aż wszystkie zwierzęta z jednej klatki zostaną poddane procedurze. Po zakończeniu zabiegu myszy poddawane są perfuzji wewnątrzsercowej 4% paraformaldehydem.

W PBS jelita zostają następnie wyjęte poprzez sekcję i umieszczone w 15% sacharozy na noc. Następnego dnia tkankę przenosi się do 30% sacharozy i ponownie inkubuje przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie tkanka jest umieszczana w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza i przechowywana do czasu użycia. Przy użyciu kriotomu przygotowuje się 20 mikronowe przekroje jelita.

Przekroje są przenoszone na szkiełka, a następnie przeprowadza się procedury blokowania i immunostainingu. Następnie stosuje się przeciwciała anty-beta three tubulin oraz Antifa synuclein. Zaleca się, aby analiza danych została przeprowadzona w sposób ślepy przez osobę zewnętrzną.

Aby rozpocząć analizę, uruchom oprogramowanie Fiji. Otwórz plik obrazu konfokalnego. Następnie rozdziel kanały, aby umożliwić niezależną pracę na każdym z nich.

Zamknij kanały, które nie będą używane, a następnie wybierz, przeanalizuj, ustaw i przeskaluj, ustawiając rozmiar piksela na jeden. Ustaw znaną odległość na 0,13 i kliknij global. Rozmiar obrazu zostanie teraz wyświetlony w mikronach.

Wybierz kanał alfa synukleiny i zaznacz zwoj ganglion. Upewnij się, że zaznaczenie obejmuje ganglion na wszystkich przekrojach. Zduplikuj obraz z zaznaczonym jedynie ganglionem; zostanie zduplikowany obraz o rozmiarze samego ganglionu.

Po naciśnięciu przycisku edycji, obszar obrazu poza wybranym regionem stanie się czarny. Powiel obraz ponownie, aby ocenić poprawność przeprowadzonej procedury. Obrazy o niskim stosunku sygnału do szumu tła nie powinny być wykorzystywane do analizy obrazu.

Wybierz opcję dostosowania progu obrazu (image adjust threshold). Następnie wybierz maksymalną entropię (max entropy). Następnie przejrzyj przekroje w przyciętym obrazie oraz w obrazie oryginalnym, aby upewnić się, że procedura przebiegła pomyślnie.

Próg tropikalny (tropic threshold) wybiera poziom sygnału intensywności na podstawie histogramu obrazu; w procesie selekcji obrazu w kolorze białym na czarnym wyświetlane będą tylko te piksele, których intensywność przekracza ten próg. Następnie kliknij „smooth”. Ten krok przekształca poszarpane krawędzie obrazów w krawędzie gładkie.

Następnie kliknij binary i wybierz Make binary. Obraz zostanie wyświetlony jako czarno-biały duplikat; aby wykonać kolejny krok na powielonym obrazie, kliknij analyze, a następnie analyze particles. Następnie zaznacz show outlines i kliknij summarize.

Pozostałe ustawienia powinny pozostać domyślne. Funkcja ta rozpoznaje całkowitą liczbę pikseli z sygnałem oraz te, które są zgrupowane, co stanowi całkowitą powierzchnię pikseli z sygnałem. Ponadto raportowana jest liczba grup pikseli oraz ich średnia wielkość.

Porównaj i wybierz przekrój o największej całkowitej powierzchni, który jest odpowiednio dopasowany. Przekrój zostanie zaznaczony. Skopiuj tabelę danych zawierającą całkowitą powierzchnię alfa-synukleiny, liczbę inkluzji oraz średnią wielkość cząsteczek.

Wklej dane do arkusza Excel lub zapisz je w innym miejscu z odpowiednimi opisami. Powróć do programu Fiji. Znajdź poprzednio wybrany przekrój w kanale beta-tubuliny i zaznacz go.

Zaznacz obszar zwoju i kliknij analizuj. Następnie wybierz pomiar. Pojawi się kolejna tabela przedstawiająca całkowitą powierzchnię zwoju.

Wyodrębnij dane z tabeli do arkusza Excel w pobliżu pomiaru alfa-synukleiny lub skopiuj je w inne miejsce przy użyciu programu Excel. Podziel poszczególne parametry uzyskane w pomiarze alfa-synukleiny przez powierzchnię zwoju, aby otrzymać całkowitą powierzchnię alfa-synukleiny oraz liczbę inkluzji znormalizowaną do wielkości zwoju. W celu analizy efektów miejscowego działania rotenonu na jelitowy układ nerwowy, jednorocznym myszom C 57 black six podano doustnie przez zgłębnik 5 mg/kg pestycydy rotenonu. Przedstawiony tutaj chromatogram wykazuje obecność piku rotenonu godzinę po podaniu; myszy kontrolne, myszy traktowane dawką 20 mg/kg rotenonu oraz 5 mg/kg rotenonu.

Poziomy rotenonu w ekstraktach z krwi, mózgu i pnia mózgu określono za pomocą metody HPLC, jak pokazano tutaj. Podanie pięciu miligramów na kilogram rotenonu drogą zgłębnika nie skutkuje mierzalnymi poziomami w krwi jedna, dwie lub trzy godziny po podaniu leku, co określono za pomocą HPLC. Grafika przedstawia poziomy rotenonu w mózgu i pniu mózgu myszy poddanych badaniu.

Godzinę po podaniu rotenonu w dawce 10 mg/kg lub mniejszej nie stwierdzono obecności rotenonu w próbkach mózgu ani pnia mózgu. Godzinę po podaniu oceniono aktywność kompleksu I mitochondriów w próbkach mięśni i mózgu myszy w wieku 1,5 miesiąca. Między grupami nie stwierdzono istotnych różnic, co wskazuje na brak inhibicji kompleksu I mitochondriów, potwierdzając tym samym brak rotenonu w tych obszarach.

Analiza komponentu ciał Lewy w chorobie Parkinsona, alfa-synukleiny, po podaniu rone pozwala na wiarygodne określenie całkowitej ilości powierzchniowej alfa-synukleiny, obecności inkluzji alfa-synukleiny oraz wzorca rozmieszczenia alfa-synukleiny w komórce. Na tej ilustracji przedstawiono barwienie przeciwciałem anty-beta-III-tubulinie, alfa-synukleinie oraz DAPI w przekrojach dwunastnicy i jelita cienkiego, co widać tutaj. Półtoramiesięczna terapia roach known wywołała zwiększenie punktowego wzorca alfa-synukleiny w zwojach jelitowego układu nerwowego, nawet w porównaniu z grupą kontrolną po trzech miesiącach.

Wzorzec ten można zaobserwować zarówno w jelicie krętnym, jak i w dwunastnicy. Po trzech miesiącach leczenia w barwieniu immunofluorescencyjnym z użyciem przeciwciał przeciwko alfa-synukleinie można dostrzec formowanie się większych inkluzji alfa-synukleiny; zastosowanie przeciwciał przeciwko alfa-synukleinie, theof, flawinie i DPI wykazuje agregację większych skupień alfa-synukleiny wyłącznie w trzecim miesiącu. Eksperyment ten przeanalizowano przy użyciu metod automatycznej segmentacji oraz progowania opartego na entropii.

Na wykresie po lewej stronie każda kolumna przedstawia całkowity stosunek powierzchni alfa-synukleiny do powierzchni zwoju. Na wykresie po prawej stronie każda kolumna przedstawia całkowitą liczbę inkluzji alfa-synukleiny na pobraną powierzchnię zwoju. Wspólnie dane te sugerują, że miejscowe podanie rotenonu indukuje fosforylację, akumulację i agregację alfa-synukleiny wraz z gliozą w zwojach jelitowego układu nerwowego. Po opanowaniu techniki ta może zostać wykonana w ciągu jednej minuty na zwierzę, jeśli jest przeprowadzana prawidłowo.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby delikatnie wprowadzać zgłębnik do żołądka; w przypadku napotkania jakichkolwiek przeszkód lepiej go wyciągnąć i wprowadzić ponownie, postępując zgodnie z opisanymi krokami. Można zastosować inne metody, takie jak HPLC, barwienie immunologiczne oraz analiza obrazu. Pozwoli to na analizę innych obszarów, efektów działania substancji, a nawet obecności substancji we krwi po jej podaniu.

Technika ta utorowała drogę neurobiologom do badania wpływu neurotoksyn środowiskowych na jelitowy układ nerwowy. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś być w stanie prawidłowo zastosować wzornik oraz przeanalizować obrazy uzyskane z immunochemii. Pamiętaj, że praca z zepsutymi materiałami może być niezwykle niebezpieczna.

W związku z tym zalecamy stosowanie rękawiczek i maseczek podczas wykonywania tej procedury.