Wizualizacja replikacji mitochondrialnego DNA w pojedynczych komórkach poprzez amplifikację sygnału EdU

Ogólnym celem niniejszej procedury jest znakowanie i wizualizacja replikacji mtDNA w hodowlanych neuronach. Jest to osiągane poprzez inkubację neuronów z analogiem tymidyny EDU przez okres od dwóch do 24 godzin. Drugim krokiem procedury jest znakowanie EDU zawierającego alkin przy użyciu fluorescencyjnego barwnika Oregon Green 488 azide w miedziowo katalizowanej reakcji kowalencyjnej.

Ostatnim krokiem procedury jest wzmocnienie sygnału orgon green za pomocą etapu wzmocnienia sygnału aramide, aby zwizualizować EDU wbudowane w nowo syntetyzowane MT DNA. Ostatecznie można uzyskać wyniki wykazujące replikację MT DNA w określonych przedziałach subkomórkowych neuronów dzięki połączeniu chemii clicka EDU i następnego wzmocnienia sygnału tear mind. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak znakowanie BRDU, jest to, że znakowanie EDU jest łatwiejsze i łagodniejsze, co pozwala na dodatkowe barwienie immunofluorescencyjne markerów neuronalnych.

Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące regulacji liczby mitochondriów, takie jak sposób, w jaki neurony dostosowują się do zmieniającego się zapotrzebowania energetycznego w swoich przedziałach subkomórkowych, w tym w ciałach komórek, aksonach, dendrytach i zakończeniach synaptycznych. Dzięki temu metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat mechanizmów leżących u podstaw patogenezy wielu neurologicznych chorób mitochondrialnych, w tym neuropatii i neurodegeneracji. Co istotne, można ją również zastosować w innych układach, w których zmiany w liczbie kopii mtDNA prawdopodobnie leżą u podstaw patogenezy stanu chorobowego, w tym w przypadku toksyczności leków, nowotworów oraz starzenia się organizmu.

W tym filmie zostanie zademonstrowano, jak znakować nowo zsyntetyzowane mitochondrialne DNA (w skrócie mtDNA) w neuronach z zwojów korzeniowych tylnych, które hodowano na sterylnych szkiełkach nakrywkowych o średnicy 12 mm. W 24-dołkowej płytce hodowlanej należy rozcieńczyć 10 mM roztwór zapasowy 5-etynylo-2'-deoksyurydyny (w skrócie EdU) z zestawu Clicka EdU Microplate assay kit w stosunku 1:100 w pożywce hodowlanej, aby uzyskać 10-krotny roztwór zapasowy EdU. Następnie 10-krotny roztwór zapasowy EdU dodaje się bezpośrednio do pożywki w każdym dołku. Traktowane neurony należy inkubować od 2 do 24 godzin w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w komorze wyciągowej.

Utrwal neurony w 2% Paraformaldehydzie przez 10 do 15 minut w temperaturze pokojowej. Przemyj dwa razy w 1x PBS, wykonując każde płukanie przez dwie do pięciu minut. Utrwalone neurony można przechowywać w świeżym 1x PBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza do jednego miesiąca.

Przygotować komorę wilgotną zgodnie z opisem w tekście towarzyszącym. Za pomocą pęsety z cienkimi końcami przenieść 28 utrwalonych szkiełek nakrywkowych, w tym pozytywne i negatywne kontrole EDU, na arkusze hydrofobowej paraformy M wewnątrz komory wilgotnej. Nanieść ponownie 200 do 300 µL 1x PBS, aby pokryć powierzchnię każdego szkiełka nakrywkowego.

Przygotuj zestaw do analizy typu click zgodnie z opisem w tekście oraz instrukcjami producenta, aby oznakować mitochondrialne DNA; nanieś od 75 do 80 µL roztworu przepuszczalnego zawierającego 0,1% Triton X w 1x PBS na każdy szkiełko przedmiotowe i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Użyj pipety transferowej z końcówką 200 µL przymocowaną do końca, aby delikatnie usunąć ciecz, nie tracąc przy tym komórek.

Za pomocą pipety z gruszką delikatnie zalej szkiełko nakrywką. Dodaj od 200 do 300 µL 1x PBS, aby dokładnie wypłukać poprzedni roztwór. Każde szkiełko nakrywkowe przemyj dwukrotnie.

Nanieś pipetą od 75 do 80 µL świeżego 1% nadtlenku wodoru w 1x PBS na każde szkiełko podstawowe. Inkubuj pod przykryciem przez 30 minut w temperaturze pokojowej w celu zablokowania endogennej aktywności peroksydazy. Przepłucz dwukrotnie 1x PBS, a następnie przygotuj świeży koktajl do reakcji click zgodnie z opisem w towarzyszącym tekście.

Mieszać poprzez pipetowanie w górę i w dół. Nie używać miksera vortex. Poddać neurony postfiksacji, dodając od 75 do 80 µl utrwalacza Click-iT EDU na każde szkiełko podstawowe i inkubując w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Podczas inkubacji postfiksacyjnej rozcieńczyć koktajl reakcyjny równą objętością utrwalacza Click-iT EDU.

Dodaj koktajl reakcyjny do każdego szkiełka podstawowego, zabezpieczając je przed światłem, i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 25 minut. Delikatnie usuń koktajl reakcyjny i przemyj dwukrotnie rozcieńczonym 1x buforem blokującym pod mikroskopem epifluorescencyjnym. Po zakończeniu barwienia EDU sprawdź barwienie jąder Organ Green.

Rozpocznij amplifikację sygnału tyraminowego (TSA), dodając 1% roztwór blokujący TSA do każdej szkiełka cover slip i inkubując w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Krótko odwiruj zapas przeciwciała anty-green horse radish peroxidase (konjugat z peroksydazą chrzanową), przygotowany od dwóch do 24 godzin przed TSA. Rozcieńcz przeciwciało pierwszorzędowe w stosunku 1:300 w roztworze blokującym TSA i wymieszaj przez odwracanie lub pipetowanie; nie stosuj vortexa. Dodaj 75 µL do każdego szkiełka cover slip i inkubuj w temperaturze 4 °C przez noc.

Następnego dnia trzykrotnie wypłucz próbki za pomocą 1X PBS w temperaturze pokojowej. Inkubuj szkiełka nakrywki w ostatnim płukaniu przez dodatkowe 30 do 60 minut, aby upewnić się, że niezwiązane przeciwciała pierwszorzędowe zostały usunięte. Przygotuj odczynnik do reakcji IDE zgodnie z opisem w tej procedurze bezpośrednio przed użyciem.

Inkubować szkiełka nakrywkowe z reakcją IDE przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Przemyć trzykrotnie roztworem XPBS, inkubując podczas ostatniego płukania przez 30 do 60 minut, analogicznie jak poprzednio, obserwując pod mikroskopem. Sprawdzić znakowanie MT DNA, a następnie zamontować pomyślnie zabarwione neurony na szkiełkach przedmiotowych, używając medium montażowego ANTIFA zawierającego DPI. Przedstawione tutaj obrazy z kontrastu interferencyjnego są reprezentatywnymi obrazami neuronów z embrionalnych i dorosłych zwojów korzeni grzbietowych, które są zazwyczaj wykorzystywane do analizy.

Niniejsze schematy przedstawiają procedurę znakowania EDU w MTD NA za pomocą zielonego sygnału fluorescencyjnego. Mitotycznie aktywne komórki neuroblastoma F 11 służą jako kontrola pozytywna i ilustrują wzorzec znakowania EDU włączonego do DNA jądrowego i mitochondrialnego na reprezentatywnych obrazach fluorescencyjnych nałożonych na obraz w polu jasnym. Zielone sygnały punktowe wskazują wzmocniony sygnał EDU włączony do nowo syntetyzowanego M-D-D-N-A w neuronach zwojów korzeni grzbietowych zarówno zarodkowych, jak i dorosłych.

Procedura znakowania EDU umożliwia późniejsze barwienie immunofluorescencyjne markerów neuronalnych, takich jak neurofilament, kolorem czerwonym. Przedstawione schematy ilustrują procedurę znakowania EDU i MTD NA czerwonym sygnałem fluorescencyjnym. Mitotycznie aktywne komórki neuroblastoma F 11 służą jako kontrola pozytywna i obrazują wzór znakowania EDU wbudowanego w DNA jądrowe i mitochondrialne.

Ten schemat przedstawia procedurę znakowania BrdU w nowo syntetyzowanym mtDNA sygnałem fluorescencyjnym w kolorze zielonym lub czerwonym. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest przeprowadzenie kontroli z wykorzystaniem komórek aktywnych mitotycznie, aby sprawdzić poprawność znakowania EdU oraz widoczność jąder komórkowych przed przejściem do etapów amplifikacji w celu wizualizacji znakowania mtDNA zgodnie z poniższą procedurą. W celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak sposób regulacji syntezy mtDNA w konkretnych subpopulacjach neuronów lub przedziałach neuronalnych, można zastosować inne metody, np. standardową immunofluorescencję. Dzięki opracowaniu tej techniki badacze z dziedziny neurobiologii zyskają możliwość badania regulacji liczby mitochondriów w modelach hodowlanych odzwierciedlających zarówno prawidłową fizjologię, jak i modelach symulujących procesy chorobowe.

Stany neurologiczne.