Wytwarzanie mikrotkanek z wykorzystaniem modułów żelu kolagenowego zawierającego komórki

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wytworzenie modułowych mikrotkanek, które mogą być wykorzystywane w eksperymentach z zakresu inżynierii tkankowej. Osiąga się to poprzez najpierw zaciągnięcie roztworu kolagenu do rurki polietylenowej za pomocą strzykawki, a następnie żelowanie kolagenu. Drugim krokiem jest pocięcie rurki polietylenowej na odcinki o długości dwóch milimetrów w celu utworzenia modułów mikrotkanek.

Trzecim krokiem procedury jest oddzielenie modułów od cewek, a na koniec moduły są pokrywane komórkami śródbłonka. Ostatecznie otrzymane mikro tkanki mogą być wykorzystane w testach komórkowych in vitro do badania interakcji komórek za pomocą komory mikrofluidycznej. Ponadto mikro tkanki mogą zostać zaimplantowane w celu wytworzenia tkanek do badania interakcji i przebudowy mikro tkanek in vivo.

Witam, nazywam się Brendan Long i reprezentuję laboratorium Sepan na Uniwersytecie w Toronto. Główną przeszkodą w tworzeniu dużych trójwymiarowych substytutów tkanek jest brak szybkiej waskularyzacji po implantacji. W tym filmie pokażemy Państwu, jak stworzyć modularną tkankę pokrytą komórkami endotelialnymi, aby pomóc pokonać to ograniczenie.

Procedurę zademonstruje Chamberlain, stażysta po studiach z laboratorium Septin. Ilość kolagenu do neutralizacji będzie zależała od długości rurki polietylenowej. W tej demonstracji użyjemy dwumetrowej rurki polietylenowej o średnicy wewnętrznej 0,76 millimeter i średnicy zewnętrznej 1,22 millimeter.

Aby przygotować rurkę, wprowadź igłę 20 G do jednego z jej końców, a następnie umieść rurkę w samouszczelniającej torebce do konwertera w celu sterylizacji gazowej. Ponieważ jeden mililitr kolagenu wypełnia około dwóch metrów rurki polietylenowej, zneutralizujemy jeden mililitr kolagenu. Umieść kolagen w stożkowej probówce o pojemności 15 ml i przechowuj probówkę w lodzie.

Do probówki dodać 128 µL 10 x alpha-MEM na każdy mililitr kolagenu i wymieszać poprzez wielokrotne pipetowanie roztworu. Należy uważać, aby zminimalizować powstawanie pęcherzyków powietrza; roztwór powinien zmienić kolor na żółty w miarę mieszania się alpha-MEM z zakwaszonym kolagenem. Następnie zneutralizować kolagen, dodając wodorowęglan sodu o stężeniu 0,8 M. Aby w przybliżeniu ocenić pH, dodawać wodorowęglan sodu do momentu, aż żółty roztwór kolagenu przybierze jasnoróżowy kolor.

Zazwyczaj potrzeba od 30 do 60 µL na mililitr kolagenu, aby osiągnąć pH 7,4. Aby zapobiec żelowaniu zneutralizowanego kolagenu, należy przechowywać go w lodzie do momentu użycia. Aby rozpocząć procedurę żelowania kolagenu, należy przenieść worek zawierający wysterylizowane rurki polietylenowe do komory z laminarnym przepływem powietrza i odciąć zamknięty koniec worka, pozostawiając rurki wewnątrz.

Za pomocą wysterylizowanej pęsety przymocuj strzykawkę o pojemności 3 ml do igły 20 G, która została wcześniej wsunięta w jeden koniec rurki. Wprowadź drugi koniec rurki do zneutralizowanego kolagenu, aż jej końcówka dotknie dna probówki stożkowej, która powinna znajdować się w lodzie. Następny krok należy wykonać powoli, aby uniknąć wprowadzenia pęcherzyków powietrza do kolagenu.

Powoli wciągnij tłok strzykawki, aby pobrać kolagen do rurki polietylenowej. Po przetłoczeniu kolagenu przez rurkę wyjmij igłę o rozmiarze 20 G i włóż oba końce rurki z powrotem do worka. Po zaklejeniu worka taśmą inkubuj go w temperaturze 37 °C przez 60 minut.

Do przecięcia rurki zostanie użyte wcześniej zmontowane urządzenie tnące. Aby rozpocząć tę procedurę, umieść rurkę w sterylnej kuwecie przed urządzeniem tnącym, a następnie wprowadź rurkę do wylotu urządzenia; przygotuj probówkę stożkową o pojemności 50 ml zawierającą 25 ml pożywki dla komórek śródbłonka. Aby zebrać wycięte moduły, ustaw urządzenie na cięcie odcinków rurki o długości 2 mm, a następnie przetnij rurkę.

Inkubować wycięte moduły w 50 ml probówce stożkowej w temperaturze 37°C przez 60 minut. Aby usunąć moduły kolagenowe z probówki, wymieszać zawartość 50 ml probówki stożkowej z modułami na wirówce typu vortex z średnią prędkością przez 10 sekund. Pozostawić moduły do osadzenia się na dnie probówki, co zajmuje około pięciu minut.

Na dnie probówki utworzy się luźny osad modułów, natomiast rurki utworzą warstwę na powierzchni medium. Po osadzeniu się modułów, za pomocą szerokootworowej pipety serologicznej o pojemności 10 mililitrów, przenieś je do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Wymieszaj zawiesinę w probówce stożkowej 15 mililitrów za pomocą wortexa, a następnie pozwól modułom osadzić się jeszcze dwukrotnie.

Osiadłe moduły z drugiego i trzeciego wiru są również przenoszone do probówki o pojemności 15 mililitrów. Po usunięciu wszystkich modułów z rurek i ich połączeniu, należy uzupełnić objętość medium w probówce do pięciu mililitrów. Moduły są teraz gotowe do pokrycia komórkami śródbłonka; w kolejnym kroku zostanie przedstawione przygotowanie komórek śródbłonka do pokrycia modułów.

Najpierw należy usunąć pożywkę z komórek i przemyć je PBS. Po usunięciu PBS dodać 3 ml trypsyny EDTA i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Następnie zawiesić komórki w 7 ml pożywki i przenieść do probówki o pojemności 15 ml.

Policz komórki za pomocą cytometru hematologicznego; będziesz potrzebować 5×10⁶ komórek śródbłonka na mililitr upakowanych modułów na dnie probówki stożkowej. Odwirowaj komórki przy 300 G przez pięć minut. Resuspenduj osad komórkowy w pięciu mililitrach pożywki dla komórek śródbłonka.

Następnie do modułów dodaje się 5 mL pożywki zawierającej komórki śródbłonka. Moduły inkubuje się z komórkami śródbłonka zarówno statycznie, jak i dynamicznie; w przypadku inkubacji statycznej mieszano moduły z komórkami śródbłonka poprzez odwracanie, a następnie ustawiono probówkę pionowo w temperaturze 37 °C na 15 minut. Po 15 minutach probówkę ponownie odwrócono i inkubowano w temperaturze 37 °C przez kolejne 15 minut.

Aby przeprowadzić dynamiczną inkubację modułów z komórkami śródbłonka, należy delikatnie kołysać probówką o pojemności 15 ml w temperaturze 37°C przez 60 minut. Po zakończeniu inkubacji z komórkami śródbłonka przenieść moduły na płytkę nieprzystosowaną do hodowli tkanek i inkubować przez noc w temperaturze 37°C. Następnego dnia umieścić moduły na nowej płytce nieprzystosowanej do hodowli tkanek ze świeżą pożywką, aby usunąć nieprzylegające komórki śródbłonka. Inkubować moduły pokryte komórkami śródbłonka w temperaturze 37°C do momentu, aż komórki pokryją 100% powierzchni modułów.

Zazwyczaj trwa to około siedmiu dni. Po wyjęciu z probówki moduły mają kształt cylindryczny. Jeśli są pokryte komórkami śródbłonka, ich objętość może zmniejszyć się o nawet 50%, a ich kształt może stać się owalny; dodatkowo, w badaniu pod mikroskopem świetlnym, mogą stać się gęstsze i bardziej nieprzezroczyste.

Na tych obrazach średnica i długość modułów są oznaczone odpowiednio jako d i l. Kolejny obraz przedstawia komórki Hep G two zatopione i równomiernie rozmieszczone w modułach w momencie ich wytwarzania. Komórki zachowały wysoką żywotność, na co wskazuje zielony kolor żywych komórek.

Martwe komórki będą miały czerwony kolor, gdy komórki śródbłonka osiągną konfluencję. Na powierzchni modułów tworzą się połączenia ścisłe, co można zaobserwować za pomocą immunofluorescencji. Analiza transferu masy z barwieniem na VE-kadherynę wykazała, że moduły są w stanie utrzymać wysoką gęstość komórek bez tworzenia się rdzenia nekrotycznego wynikającego z niewystarczającego transportu tlenu, co często stanowi problem w przypadku większych tkanek.

W niniejszym przykładzie barwienie trichromowe typowych małych modułów pokazuje, że moduły zachowały jednorodny i wysoki rozkład żywych komórek siedem dni po wytworzeniu. W przeciwieństwie do nich, w rdzeniu dużych modułów utworzyła się znaczna liczba martwych komórek, pozostawiając jedynie cienki pierścień żywotnych komórek. Wytworzono również moduły z mieszaniny kolagenu i polimeru syntetycznego oraz moduły zawierające mikrosfery uwalniające lek.

W tym przypadku, gdy komórki h hm EC osadzono na modułach z kolagenu i palin, moduły zachowują swój cylindryczny kształt, a właściwości przylegania komórek są ograniczone w porównaniu z modułami składającymi się wyłącznie z kolagenu. Przedstawiono tutaj obraz z mikroskopu świetlnego modułu kolagenowego zawierającego biodegradowalne mikrosfery na bazie PLGA. Wykazano, że kilka testów in vitro jest kompatybilnych z tymi modułami.

Na przykład w teście angiogenezy formacje przypominające kapilary na module zasiedlonym komórkami śródbłonka można łatwo wykryć i określić ilościowo po pięciu dniach inkubacji z mezenchymalnymi komórkami macierzystymi pochodzącymi z tkanki tłuszczowej. W innym przykładzie obrazy z mikroskopii konfokalnej z testu żywotności komórek na modułach pokazują komórki żywe zabarwione na zielono i komórki martwe zabarwione na czerwono. Wreszcie moduły były wykorzystywane w komorach mikroprzepływowych oraz implantowane u myszy i szczurów w celu zbadania interakcji między różnymi typami komórek oraz sposobu, w jaki mikrotkanki są przebudowywane w wyniku reakcji organizmu gospodarza.

Po przeprowadzeniu procedury moduły można hodować w szalce Petriego lub w innych naczyniach, takich jak bioreaktor lub urządzenie mikroprzepływowe. Metodę tę można również dostosować w celu stworzenia różnych tkanek, stosując różnorodne kombinacje typów komórek lub rurki o różnych średnicach. Dziękujemy za oglądanie.