Przygotowanie immunogenu z przysadki mysiej do indukcji eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia przysadki

Autoimmunologiczne zapalenie przysadki charakteryzuje się powiększeniem przysadki mózgowej oraz niedoborem jednego lub więcej hormonów przysadki. Przyczynowe autoantygeny pozostają nieznane. W niniejszym materiale przedstawiono protokół przygotowania białek z przysadki mózgowej myszy do badań nad tą chorobą.

W pierwszej kolejności izoluje się przysadki mózgowe z uśpionych myszy. Następnie przysadki poddaje się homogenizacji w celu mechanicznego rozbicia komórek i uwolnienia białek cytozolowych. Homogenat oczyszcza się poprzez wirowanie z niską prędkością, a następnie określa jego ilość za pomocą kolorymetrycznego testu BCA oraz jakość poprzez elektroforezę w żelu poliakrylamidowym.

Na koniec wodny homogenat białkowy miesza się z adiuwantem olejowym. Mieszaninę tę wstrzykuje się następnie myszom w celu stworzenia modelu mysiego przypominającego autoimmunologiczne zapalenie przysadki. Jak pokazano w towarzyszącym filmie, opisano cztery techniki indukowania zapalenia przysadki u zwierząt doświadczalnych.

Technika przedstawiona w niniejszym artykule, polegająca na wstrzykiwaniu mieszanki białek przysadki jako adiuwanta grypy, jest najstarszą metodą, sięgającą lat 60. XX wieku. Inne podejścia obejmowały wstrzykiwanie rozpuszczalnych glikoprotein wirusa rubelli w 1992 roku, stereotaktyczne wstrzyknięcie adenowirusa bezpośrednio do przysadki w 2002 roku oraz transplantację przysadki z jednego szczepu szczurów pod torebkę nerkową innego szczepu szczurów w 2010 roku. Główną zaletą podejścia z wykorzystaniem adiuwanta Florence'a jest to, że obecnie jest ono mniej inwazyjne, bardziej powtarzalne i przede wszystkim dokładniejsze w indukowaniu choroby, która ściśle przypomina odpowiednik ludzki.

Mimo że technika z zastosowaniem adiuwantów obcych była zgłaszana już od lat 60., wykazywała ona niską skuteczność w indukowaniu zapalenia przysadki. Kiedy rozpoczynałem pracę nad doktoratem, stosując opublikowany protokół z adiuwantem obcym, uzyskiwałem jedynie rzadkie i łagodne przypadki zapalenia przysadki. Sytuacja uległa znacznej poprawie, gdy wpadłem na pomysł dziesięciokrotnego zwiększenia ilości białek przysadki zawartych w emulsji EM.

Choć metody te mogą dostarczyć informacji na temat patogenezy autoimmunologicznego zapalenia przysadki, mogą one być również wykorzystane do badania innych chorób autoimmunologicznych, w których autoantygeny nie zostały jeszcze zidentyfikowane. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tymi metodami będą miały największe trudności z ostatnim krokiem, czyli przygotowaniem marginesu, ponieważ wymaga on umiejętności manualnych, czasu i zaangażowania. Dlatego też demonstracja wizualna jest kluczowa dla zrozumienia sposobu prawidłowego przygotowania emulsji.

Zastosowanie tej techniki wykracza poza dziedzinę autoimmunologii. Wiedza na temat przygotowania antygenu do immunizacji może być wykorzystana również w produkcji przeciwciał monoklonalnych lub w testowaniu nowych szczepionek. Technikę tę zaprezentują S Zoo heroic Ura oraz Mayland al gato z mojego laboratorium.

Przysadka mózgowa myszy jest gruczołem o kształcie cylindrycznym, który znajduje się u podstawy czaszki w zagłębieniu kości klinowej zwanym tureckim. Gruczoł jest ograniczony bocznie przez nerwy trójdzielne, a przednio przez skrzyżowanie nerwów wzrokowych. Składa się on z większego płata przedniego oraz mniejszych płatów pośredniego i tylnego.

Aby wyizolować przysadkę mózgową, należy za pomocą nożyczek odciąć głowę uśpionej myszy, a następnie wykonać równoległe nacięcia od tyłu do przodu czaszki. Należy unieść mózg i odchylić go do tyłu, aby odsłonić przysadkę mózgową, która w kontekście trójkąta równoramiennego ma kształt cylindra, gdzie podstawą jest przysadka mózgowa, bokami nerwy trójdzielne, a wierzchołkiem skrzyżowanie wzrokowe.

Określić obrys gruczołu końcówkami zamkniętej pęsety, aby przerwać otaczającą go oponę twardą. Następnie, używając precyzyjnej pęsety, uchwycić przysadkę z siodła tureckiego i umieścić ją w plastikowej probówce na suchym lodzie. Na jedną preparatykę należy zebrać 300 przysadek mysich.

Pobranie próbek wymaga około dziewięciu roboczogodzin. Po zakończeniu procesu pobierania, przechowywać przysadki mózgowe w temperaturze -80 °C do momentu ich wykorzystania. Umieścić probówkę Falcon o pojemności 15 ml w kąpieli lodowej.

Do probówki dodać 250 µL buforu do homogenizacji. Na każde 100 przysadek pobranych bezpośrednio przed homogenizacją, przenieść przysadki mysie do buforu. Następnie umieścić końcówkę homogenizatora Polytron z generatorem o średnicy 5 mm na dnie probówki Falcon zawierającej przysadki mysie i bufor, a następnie homogenizować z maksymalną prędkością przez 30 s.

Delikatnie poruszaj probówką w górę i w dół, utrzymując ją w lodzie. Następnie pozostaw homogenat w lodzie na jedną minutę. Powtórz etapy homogenizacji i chłodzenia jeszcze dwa razy.

Ta delikatna homogenizacja powinna doprowadzić do rozpadu komórek i uwolnienia białek, nie uszkadzając przy tym jąder komórkowych. Homogenizat należy wirować z niską prędkością, około 1000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby osadzić jądra, niezniszczone tkanki oraz materiały nierozpuszczalne, takie jak tkanka łączna i zdenaturowane kompleksy białkowe, uważając, aby nie naruszyć osadu.

Przenieś nadkład, obecnie nazywany frakcją ponuklearną (PNS), do nowej probówki Falcon. Utrzymując PNS na lodzie, odwiruj osad, stosując tę samą objętość buforu homogenizacyjnego co poprzednio, a następnie przeprowadź homogenizację i wirowanie w ten sam sposób. Po połączeniu obu próbek PNS, rozlej roztwór do wielu probówek do mikrocentryfugi.

Przechowywać probówki do mikrocentryfugi w temperaturze -80 °C do momentu ich użycia. Ta preparaty białkowe są stabilne w temperaturze -80 °C, lecz stopniowo tracą swoją aktywność. Dlatego zaleca się ich zużycie w ciągu sześciu miesięcy od przygotowania.

Zachowaj jedną małą alikwot PNS w celu oznaczenia wydajności i stężenia białka za pomocą testu kwasu bielskiego. Następnie określ jakość białka za pomocą elektroforezy żelowej z 300 przysadek myszych, których średnia masa całkowita wynosi około 570 milligrams. Przewidywana wydajność to 60 milligrams białek przysadki lub one milligram białka na każde 10 milligrams tkanki.

Stężenie białka wynosi zazwyczaj około 40 mg/mL. Przedstawiony tutaj przykład dotyczy immunizacji 10 myszy. Plan zakłada wstrzyknięcie każdej myszy 100 µL emulsji zawierającej 1 mg białka przysadki; uwzględniając dwie dodatkowe myszy na wypadek strat materiału podczas przygotowania, przygotowuje się 12 mg emulsji białkowej.

Zacznij od szybkiego rozmrożenia zamrożonych alikwotów białka poprzez ogrzanie ich w dłoniach. Dostosuj stężenie białka do 20 mg/mL za pomocą PBS. Następnie pobierz 600 µL ekstraktu białkowego z przysadki odpowiadającego 12 mg do strzykawki Gas Tite Hamilton o pojemności 2,5 mL i resuspenduj w pełnym adjuwancie FRONS lub CFA zawierającym 5 mg/mL zabitych ciepłem mycobacterium tuberculosis poprzez ręczne wstrząsanie.

Następnie pobierz 600 µL CFA do drugiej strzykawki Hamiltona o pojemności 2,5 ml. Do strzykawki wypełnionej CFA przymocuj i zabezpiecz mikroemulsyjną igłę o rozmiarze 22G. Powoli przesuń tłok tak, aby igła została wypełniona CFA.

Następnie przymocuj i zabezpiecz drugi koniec igły do drugiej strzykawki wypełnionej ekstraktem białek przysadki. Unikaj uwięzienia pęcherzyków powietrza wewnątrz strzykawek. Powoli wysuń tłok strzykawki z CFA, aby wprowadzić komponent olejowy do wodnego ekstraktu z przysadki w taki sposób, aby wymieszać jedynie niewielką ilość.

Następnie wciśnij tłok strzykawki z ekstraktem przysadki do strzykawki z CFA. Powtarzaj tę czynność, stopniowo zwiększając ilość mieszanego materiału, aż do wymieszania całej zawartości. Ten białawy i równomiernie rozłożony materiał stanowi emulsję wodno-olejową.

Po utworzeniu emulsji powtórz pełny cykl ruchu w przód i w tył co najmniej 500 razy; po ostatnim cyklu strzykawki będą zawierać emulsję wody i oleju w stosunku jeden do jednego, w której stężenie białka przysadki wynosi obecnie 10 mg/mL. Emulsja jest gotowa do użycia; aby sprawdzić jej jakość, należy dodać jedną kroplę do zlewki z wodą. Jeśli emulsja została przygotowana prawidłowo, kropla pozostanie zwarta i gęsta na powierzchni.

Jeśli emulsja jest słabej jakości, będzie się rozprzestrzeniać i rozpadać na mniejsze krople. Emulsję wstrzykuje się w dniu jej przygotowania myszom szczepu SJL w celu wywołania eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia przysadki. Protokół ten jest szczegółowo opisany w towarzyszącym materiale jo of vertical.

Po pobraniu przysadki i opanowaniu technik, izolację białek można przeprowadzić w ciągu jednej godziny, pamiętając o szybkim tempie pracy i utrzymywaniu próbek w lodzie. Podczas tego etapu, podczas przygotowania imersji, co zajmuje około jednej godziny. Należy pamiętać o powolnym i cierpliwym działaniu w początkowej fazie mieszania po jej przygotowaniu.

Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie autoimmunologii do zgłębiania mechanizmów, za pomocą których limfocyty autoreaktywne rozpoznają narząd docelowy i infiltrują go. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak przygotować ekstrakt białkowy z przysadki mózgowej myszy oraz jak zmieszać go z adjuwantem Freunda, aby przygotować emulsję gotową do użycia jako immunogen. Należy pamiętać, że praca ze strzykawkami i kompletnym adjuwantem Freunda, który zawiera inaktywowany i wysuszony prątek gruźlicy, może być niebezpieczna w przypadku przypadkowego nakłucia.

Dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze używać rękawiczek i prawidłowo utylizować igły.