Mikrofabrykowane platformy do mechanicznie dynamicznej hodowli komórek

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest mikrofabrykacja urządzeń służących do mechanicznej stymulacji komórek w dwu- i trójwymiarowych środowiskach hodowlanych. Jest to realizowane poprzez zastosowanie techniki wielowarstwowego formowania i układania warstw (sandwich molding and stacking), aby wytworzyć macierz pionowo aktywowanych mikrosłupków. W drugim kroku macierz pionowo aktywowanych mikrosłupków jest modyfikowana w celu rozciągania filmu hodowlanego, co pozwala na przykładanie precyzyjnie kontrolowanych odkształceń do komórek hodowanych na tym filmie.

Alternatywnie matrycę można zmodyfikować w celu kompresowania mikrowzorowanych konstrukcji z biomateriałów, aby zastosować stymulację mechaniczną do komórek. Hodowla w matrycy trójwymiarowych hydrożeli pozwala na uzyskanie wyników, które na podstawie analizy obrazu fluorescencyjnych markerów referencyjnych wykazują jednoczesne zastosowanie zakresu dwuwymiarowych odkształceń echo-dwuosiowych oraz trójwymiarowych odkształceń kompresyjnych w całej matrycy. Cześć, jestem Chris Mariahs z laboratoriów Craiga Simmonsa i U Suna w Departamencie Inżynierii Mechanicznej i Przemysłowej oraz Instytucie Biomateriałów i Inżynierii Biomedycznej na Uniwersytecie w Toronto.

Dzisiaj przedstawimy procedurę wykonania mikrourządzeń służących do mechanicznej stymulacji komórek. W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę, aby badać reakcje komórek na różne siły mechaniczne w hodowli in vitro. Przejdźmy zatem do części praktycznej.

Proces wykonania formy kanapkowej obejmuje nałożenie folii przezroczystej na nieutwardniony polidimetylosiloksan (PDMS) na matrycy SU8. Kanapka zostaje umieszczona w stosie z pianki szklanej i metalu, a następnie utwardzona w piecu pod kompresją. Na koniec stos zostaje rozmontowany, a folia przezroczysta oddzielona, co pozwala na zachowanie warstwy PDMS z nadanym wzorem.

Aby rozpocząć ten proces, należy dokładnie wymieszać PDMS, monomer i utwardzacz. W standardowym stosunku 10:1 nanieś trzy mililitry nieutwardzonej mieszaniny PDMS na wcześniej wykonaną matrycę SU-8, a następnie odgazuj polimer w komorze próżniowej. Następnie umieść podkładkę z pianki oraz matrycę SU-8 na pleksiglasowej płytce podstawowej.

Ostrożnie nałóż gładką stronę folii do drukarek atramentowych na nieutwardzony PDMS, uważając, aby nie uwięzić pęcherzyków powietrza. Następnie umieść zasiloną szkiełkiem przedmiotowym podkładkę szklaną na folii, pod drugą podkładką z pianki i pleksiglasową płytą górną. Zaciśnij cały zestaw za pomocą ścisku śrubowego.

Utwardzaj kanapkę z PDMS w piekarniku w temperaturze 80 °C przez co najmniej cztery godziny. Po utwardzeniu wyjmij kanapkę z piekarnika i poczekaj, aż ostygnie. Po ostygnięciu zdejmij zacisk i rozmontuj kanapkę.

Ostrożnie odklej folię przezroczystą od matrycy SU-8, zachowując naniesioną warstwę PDMS. Przytnij krawędzie folii z wzorem, aby usunąć nadmiar PDMS; przechowuj warstwy wzoru w środowisku wolnym od kurzu do momentu ich użycia. Kolejna część tego protokołu obejmuje konstrukcję mikrofabrykowanej macierzy pionowo sterowanych słupków.

Do wykonania macierzy mikrofilarów wymagany jest wielowarstwowy proces wytwarzania. Najniższa wzorowana warstwa PDMS jest przygotowywana metodą odlewu kanapkowego. W tych eksperymentach zastosowano wzory okrągłe o średnicy od 600 do 1 200 mikronów.

Aby przenieść warstwę PDMS na czystą szkiełko przedmiotowe, należy użyć urządzenia do wyładowań koronowych w celu potraktowania powierzchni PDMS oraz szkła plazmą tlenową. Następnie należy doprowadzić do kontaktu obu powierzchni. Cały zestaw należy umieścić na płycie grzejczej w temperaturze 80 °C przez 10 minut, aby zakończyć proces wiązania.

Oderwij folię przezroczystą i wyrzuć ją. Proces ten gwarantuje, że wzorowana warstwa PDMS nie zostaje oddzielona od sztywnego podłoża, co zapobiega kurczeniu się poszczególnych warstw. Druga warstwa formowana metodą kanapkową powstaje jako negatywowa kopia formy pożądanej membrany i struktury słupków.

W tej demonstracji do utworzenia tej warstwy wykorzystano okrągłe słupki o średnicy 500 µm. Najpierw tymczasowo przymocowano negatywową formę odlewniczą do szkiełka przedmiotowego za pomocą dwustronnej taśmy, a następnie w przenośniku próżniowym naniesiono nieutwardzony PDMS na tak przygotowany układ. Odgazowano i rozwirowano przez 45 s z prędkością 1000 obr/min, otrzymując membranę aktywacyjną o grubości 60 µm. Warstwę PDMS naniesioną metodą spin-coatingu częściowo utwardzono w temperaturze 80 °C przez około 20 min lub do momentu, aż PDMS stał się lepki, ale nie ulegał trwałej deformacji przy dotyku. Następnie usunięto szkiełko przedmiotowe oraz dwustronną taśmę z częściowo utwardzonej warstwy PDMS i folii przezroczystej, a następnie przymocowano ją do pary szkiełek manipulacyjnych i poddano działaniu plazmy.

Poddaj częściowo utwardzony PDMS obróbce, a następnie odwróć go i umieść w specjalnie wykonanym pozycjonerze. Pozycjoner składa się z uchwytu próżniowego zamontowanego na mikromanipulatorze. Następnie poddaj pierwszej warstwie PDMS obróbce plazmowej, a potem umieść ją na stole obrotowym pod uchwytem próżniowym.

Obserwuj dopasowanie obu warstw za pomocą systemu wizyjnego z 12-krotnym powiększeniem. Używając manipulatora, wyrównaj warstwy i ostrożnie doprowadź do ich kontaktu. Przyciśnij warstwy lekko palcem, aby je do siebie przytwierdzić.

Następnie wyjmij kanapkę z wyrównywacza. Usuń szklane slajdy manipulacyjne i upewnij się, że warstwy w pełni ze sobą kontaktują. Utwardzaj w piecu w temperaturze 80 °C przez dodatkowe 30 minut.

Po 30 minutach przezroczystą i zsiloksylowaną formę replikacyjną z PDMS można odkleić od urządzenia i wyrzucić. Następnie urządzenie jest w pełni utwardzane w temperaturze 80 °C przez co najmniej cztery godziny, aby można było przeprowadzić eksperymenty na komórkach hodowanych na odkształcalnym podłożu dwuwymiarowym. Matryca mikroaktuatorów zostaje zmodyfikowana poprzez przyłączenie trzeciej warstwy PDMS do urządzenia.

Trzecia warstwa PDMS składa się z dwuwarstwowej struktury. Dolne koło odpowiada rozmiarowi komory sterującej znajdującej się pod ruchomymi mikrosłupkami. Średnica górnego koła jest o 100 mikronów większa od średnicy słupków do ładowania.

Mikrokanał o szerokości 200 micronów łączy te elementy z obszarem przyłącza i służy do smarowania słupków załadowczych oraz folii hodowlanej. Aby zmodyfikować urządzenie do hodowli 2D, należy najpierw wykonać i przykleić do niego złącza zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Następnie należy nanieść metodą spin-coatingu warstwę PDMS o grubości od 10 do 15 micronów na gładką stronę folii przezroczystej i utwardzić ją.

Cienka warstwa PDMS w temperaturze 80 °C przez co najmniej cztery godziny. Kolejnym krokiem jest zastosowanie próżni w siłownikach i połączenie warstwy PDMS z urządzeniem. Aby to osiągnąć.

W pierwszej kolejności zastosuj próżnię o niskim poziomie do siłowników, obniżając matrycę słupków poddanych obróbce plazmowej i wiązaniu. Po naniesieniu metodą spin-coatingu filmu PDMS na urządzanie mikrofluidyczne z siłownikami, zgodnie z opisem w protokole pisemnym, słupki i film hodowlany pozostaną hydrofilowe przez krótki czas. Następnie podłącz strzykawkę z lubrykantem do urządzenia i wypełnij kanały smarne 90% roztworem glicerolu w wodzie dejonizowanej.

Oprócz smarowania, ta formulacja nieograniczoną w czasie utrzymuje hydrofilowość PDMS, redukując współczynniki tarcia. Umieść urządzenie na płycie grzejnej w temperaturze 40 °C i kontynuuj wstrzykiwanie środka smarnego do kanału, powodując niewielki wzrost ciśnienia. Po kilku minutach pęcherzyki powietrza rozprzestrzenią się przez PDMS, a wszystkie powierzchnie zostaną nasmarowane.

W ostatnim kroku należy usunąć podciśnienie, uwalniając słupki za pomocą skalpela. Wyciąć obszar wokół cienkiej folii PDMS. Ostrożnie oddzielić folię zabezpieczającą od połączenia plazmowego urządzenia.

Ręcznie wycięta uszczelka z PDMS wokół obszaru hodowli urządzenia. Sterylizujemy urządzenie poprzez namoczenie go w 70% etanolu przez pięć minut, a następnie naświetlanie bakteriobójczym światłem UV w komorze z laminarnym przepływem powietrza przez 45 minut. Powierzchnię poddajemy działaniu plazmy i inkubujemy z 100 µg/mL kolagenu przez noc w temperaturze 4 °C.

Po inkubacji przez noc urządzenie należy przemyć sterylnym roztworem soli fizjologicznej z buforem fosforanowym lub PBS, a następnie zasiać komórki w zagęszczeniu od 10 do 15 000 komórek na centymetr kwadratowy. Zgodnie ze standardowymi protokołami hodowli komórkowych, matrycę mikroaktuatorów można zmodyfikować w celu prowadzenia eksperymentów na komórkach hodowanych w trójwymiarowych fotowzorowanych konstrukcjach hydrożelowych. W pierwszej kolejności przygotowuje się wielowarstwową platformę opartą na PDMS.

Po pokryciu podstawy platformy szkłem przedmiotowym, wstrzykiwany jest związany z nim roztwór prekursora hydrożelu. Następnie fotopolimeryzowalny biomateriał jest mikrostrukturyzowany w postaci macierzy, a pozostały roztwór prekursora jest wypłukiwany. Macierz pionowo działających słupków obciążających może być następnie wykorzystana do przyłożenia ściskających sił mechanicznych do komórek hodowanych w trójwymiarowych biomateriałach; przy użyciu kawałków taśmy klejącej maskuje się obszary wokół słupków, a następnie urządzenie pokrywa się paraleną C w systemie PDS 2010 Lab Coater 2.

Zwiększy to kinetykę polimeryzacji dla systemu biomateriałowego. Po pokryciu wyjąć urządzenie z systemu powlekania i odkleić taśmę klejącą, pozostawiając konformalną warstwę parylenu C na słupkach. Następnie przeprowadzić metylację szkiełka przedmiotowego ACRL poprzez zanurzenie w 2% (obj. obj.) roztworze trimetoksysilanu propylmetakrylanu w 95% etanolu przez dwie minuty.

Opłucz szkiełko przykrywowe. Zanurz je w 100% etanolu, a następnie poddaj wypalaniu w temperaturze 100 °C, aby na powierzchni pozostały grupy metakrylowe. Odlej odstępnik z PDMS o grubości 200 micron.

Wyściełij szalkę Petriego folią i potnij ją na małe fragmenty. Przymocuj za pomocą wiązania plazmowego cztery z tych małych fragmentów wokół krawędzi szkiełka nakrywkowego powiązanego z meac. Następnie przymocuj za pomocą wiązania plazmowego wolne przestrzenie do obszarów PDMS urządzenia, pokrywając obszary powlekane Lene C.

Na koniec wysterylizowano urządzenie, myjąc je w 70% etanolu, a następnie poddano działaniu środka bakteriobójczego lub światła UV w komorze bezpieczeństwa biologicznego przez 45 minut. W celu fotolitograficznego wzorowania hydrożeli PEG z zawartością komórek w urządzeniach, należy przygotować roztwory prekursora i fotoinicjatora zgodnie z opisem w protokole pisemnym i dokładnie je wymieszać, aby uzyskać roztwór o stężeniu 0,4% w/v fotoinicjatora.

Przefiltruj mieszaninę przez filtr strzykawkowy 0,45 mikrona w celu sterylizacji i usunięcia cząstek stałych, potraktuj hodowle komórkowe trypsyną w lodzie i przygotuj zawiesinę komórkową w pożywce hodowlanej o dwukrotnym stężeniu komórek względem pożądanej wartości końcowej. Następnie zmieszaj zawiesinę komórkową i przefiltrowany roztwór fotoinicjatora prekursora hydrożelu w stosunku jeden do jednego. Wstrzyknij roztwór do mikrourządzenia, używając długiej igły 25G.

Należy starannie unikać uwięzienia pęcherzyków powietrza w urządzeniu. Dopasować wydrukowaną maskę na folii przezroczystej do znaczników wyrównawczych na powierzchni urządzenia. Skonfigurować system naświetlania UV tak, aby zapewnić dawkę UV o długości fali 365 nanometrów o natężeniu 17,5 milliwatt per square centimeter na powierzchni urządzenia.

Naświetlaj hydrożel przez maskę przez 195 sekund po rozpoczęciu iluminacji. Wypłucz niepolimeryzowany roztwór prekursora hydrożelu za pomocą PBS, a następnie zastąp PBS pożywką hodowlaną i uruchom słupki ładunkowe, aby skompresować konstrukty hydrożelowe. Tutaj przedstawiono gotowe urządzenie próbkowe do 2D mechano-stymulowanej hodowli.

Czerwony barwnik służy do oznakowania kanałów doprowadzających ciśnienie sterujące, a niebieski barwnik D do oznakowania kanałów smarowania podczas charakterystyki odkształceń. Eksperymenty mogą służyć do wyznaczania pól przyłożonego odkształcenia poprzez śledzenie ruchu fluorescencyjnych kulek na podłożach. Czerwone punkty reprezentują położenie początkowe kulek, natomiast zielone punkty reprezentują ich położenia po odkształceniu.

Przykładowe urządzenie do trójwymiarowych eksperymentów ściskania przedstawiono tutaj, gdzie zielony barwnik służy do oznaczenia kanałów ciśnienia aktywacyjnego. Widok z góry matrycy mikrofilarów ukazuje konstrukt hydrożelowy ukształtowany na szczycie filarów; obok znajdują się zrekonstruowane obrazy kulek fluorescencyjnych w konstrukcie hydrożelowym. Stan spoczynku oraz ciśnienie aktywacyjne 55 kPa demonstrują proces charakterystyki odkształcenia w trójwymiarowym systemie hodowlanym.

Właśnie pokazaliśmy Państwu, jak wykonać urządzenia służące do mechanicznej stymulacji komórek w dwu- lub trójwymiarowych systemach hodowli. Przeprowadzając tę procedurę, należy pamiętać o utrzymaniu urządzeń w maksymalnej czystości, bez kurzu, oraz o zachowaniu cierpliwości, szczególnie podczas etapów wyrównywania. To wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.