In vivo ilościowe oznaczanie oddziaływań receptorów sprzężonych z białkiem G z wykorzystaniem spektroskopowo rozdzielczej mikroskopii dwufotonowej
19 stycznia 2011
Wykorzystując system obrazowania z dwufotonową mikroskopią o rozdzielczości spektralnej, uzyskano mapy wydajności transferu energii rezonansowej Förstera (FRET) na poziomie pikseli dla komórek ekspresujących receptory błonowe, w których przypuszcza się tworzenie kompleksów homo-oligomerycznych. Na podstawie map wydajności FRET możliwe jest oszacowanie informacji stechiometrycznych dotyczących badanego kompleksu oligomeru.
Ogólnym celem następnego eksperymentu jest określenie informacji stechiometrycznych i strukturalnych na temat białka. Wszystkie kompleksy ligandów wykazujące żywe komórki biologiczne, komórki drożdży, są zmodyfikowane genetycznie w celu ekspresji białek zainteresowania przyłączonych do sondy fluorescencyjnej donora lub akceptora. Sondy donora mogą być wzbudzane bezpośrednio za pomocą lasera.
Podczas gdy akceptory mogą zostać wzbudzone jedynie poprzez transfer energii z pobliskiego wzbudzonego donora, komórki są naświetlane impulsem lasera bliskiej podczerwieni. Fluorescencja emitowana przez sondy jest rozdzielana na składowe spektralne za pomocą siatki transmisyjnej i rzutowana na powierzchnię matrycy CCD z mnożeniem elektronów. W ten sposób dla każdego punktu w próbce otrzymywane są pełne widma fluorescencji z poszczególnych ligandów.
Profil spektralny wykrytej fluorescencji zależy od specyficznej interakcji badanych białek. Dane są analizowane w celu określenia oddzielnych emisji sondy donora i akceptora dla każdego piksela obrazu komórki skanowanej. Efektywność transferu energii jest wyznaczana dla każdego piksela obrazu, a następnie piksele są grupowane zgodnie z ich efektywnością FRET i histogramem.
Interpretacja histogramu umożliwia in vivo określenie wielkości i konfiguracji białek oraz kompleksów. Cześć, nazywam się Michael Stoneman z Grupy Badawczej Riku na Uniwersytecie Wisconsin w Milwaukee. Nazywam się Singh.
Pracuję w laboratorium Rikus w Milwaukee w stanie Wisconsin. Główną zaletą tej techniki jest to, że kompletne profile emisji setek wszystkich kompleksów więzadłowych wewnątrz komórki są uzyskiwane za pomocą jednego pełnego skanowania komórki. Zazwyczaj większość metod mikroskopii fluorescencyjnej wymaga wielokrotnego skanowania badanej komórki w celu zgromadzenia wystarczających informacji spektralnych do określenia wydajności FRET w różnych obszarach zainteresowania wewnątrz komórki.
Jednakże biochemiczne reakcje dyfuzyjne mogą zmieniać skład molekularny tych obszarów zainteresowania, ograniczając tym samym informacje uzyskane podczas skanowania obrazu. Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w badaniach nad białkami i oddziaływaniami białko-białko w żywych komórkach, takie jak: jaka jest wielkość szkodliwych oligomerów? Na jakim etapie cyklu życia białka tworzą się oligomery i jaka jest rola oligomerów tego białka w funkcjonowaniu komórki?
Mikroskop dwifotonowy z rozdzielczością spektralną gromadzi informacje spektralne o kompleksach olima w komórce obrazowanej poprzez skanowanie ogniska wiązki wzbudzenia w wielu punktach badanego preparatu. Para ortogonalnych luster skanujących służy do przemieszczania ogniska wiązki lasera w poprzek próbki w dwóch różnych kierunkach. Ruch luster skanujących jest sterowany komputerowo i zsynchronizowany z ekstrakcją danych o intensywności fluorescencji z kamery CCD, co pozwala na rekonstrukcję przestrzennych map intensywności fluorescencji z przeskanowanych linii, odpowiadających konkretnej długości fali światła.
W celu dokładnej rekonstrukcji przestrzennych map natężenia fluorescencji rentgenowskiej oraz obliczenia rzeczywistej długości fali odpowiadającej każdej z tych map, protokół skanowania liniowego musi zostać skalibrowany przy użyciu roztworu fluoresceiny. Aby rozpocząć procedurę kalibracji, ustaw widmo wzbudzenia na długość fali 800 nanometrów, co stanowi dwukrotność maksymalnej długości fali wzbudzenia znacznika donora GFP two two. Aby przesunąć widmo wzbudzenia, przesuń pryzmat znajdujący się wewnątrz wnęki laserowej w celu zmodyfikowania dyspersji prędkości grupowej, korzystając z programu komputerowego, z którym połączona jest kamera. Wyślij polecenie do układu CCD, aby obniżyć temperaturę chipa CCD do najniższej możliwej wartości.
W celu zredukowania szumu ciemnego, nanieś pipetą 10 µL roztworu fluoresceiny na szkiełko przedmiotowe i przykryj je szkiełkiem nakrywnym w taki sposób, aby cienka warstwa próbki była równomiernie rozprowadzona w przestrzeni między szkiełkiem nakrywnym a przedmiotowym, a następnie nanieś małą kroplę olejku imersyjnego na powierzchnię szkiełka nakrywnego. Następnie zamocuj szkiełko przedmiotowe w stoliku translacyjnym XY, Z i przesuń szkiełko oraz stolik w kierunku osi optycznej. Ręcznie regulując siłownik liniowy, przesuwaj szkiełko aż do momentu, gdy obiektyw mikroskopu zetknie się z kroplą olejku imersyjnego; przełącz kamerę w tryb akwizycji wideo, aby światło padające na matrycę CCD było wyświetlane na ekranie komputera w czasie rzeczywistym.
Wyłącz wszystkie światła w pomieszczeniu, aby zmniejszyć poziom szumu tła wykrywanego przez matrycę CCD. Powoli reguluj mikrometr sterujący stolem translacyjnym w kierunku osi optycznej, aby wprowadzić próbkę w punkt ogniskowania wiązki laserowej. Gdy próbka fluoresceiny zostanie ustawiona w ognisku, emisja pojawi się jako ostra linia na matrycy CCD.
Pobierz odczyt intensywności pikseli z matrycy CCD do komputera. Zmierz intensywność pikseli jako funkcję położenia na matrycy CCD, otwierając pobraną macierz wartości intensywności w programie ImageJ i kreśląc linię przechodzącą przez obszar fluorescencji. Użyj polecenia image day.
Przeanalizuj profil wykresu, aby utworzyć wykres ilustrujący widmo emisji próbki fluoresceiny. Dostosuj parametr przyrostowy lustra, który steruje ruchem lasera. Ustaw ostrość w kierunku Y w taki sposób, aby sąsiednie pozycje y wewnątrz próbki powodowały przesunięcie piku widm fluorescencji o dokładnie jeden piksel wzdłuż wymiaru widmowego na matrycy CCD.
Aby monitorować ten proces, należy pobrać intensywność widma fluoresceiny dla dwóch różnych pozycji Y w próbce. Następnie należy otworzyć obrazy intensywności w programie ImageJ i wyznaczyć pozycję piksela szczytowego dla każdego z widm fluorescencyjnych. Korzystając z kursora w programie ImageJ i pozostawiając otwartą migawkę detektora CCD, należy przeskanować ogniskową lasera w poprzek próbki w kierunku X.
Światło emitowane z każdego woksela wzdłuż linii skanowania powinno padać na matrycę CCD na końcu każdego skanowania liniowego; należy zapisać dane z matrycy CCD uzyskane dla tego skanowania liniowego, a następnie wyczyścić piksele matrycy CCD. Zmienić pozycję lasera. Przesunąć ognisko w kierunku Y o wartość określoną wcześniej.
Następnie przeprowadź skanowanie wiązki lasera w kierunku X w poprzek próbki. Ponownie, pozostawiając otwartą migawkę detektora CCD, zapisz dane. Powtarzaj tę procedurę skanowania liniowego, aż laser oświetli obszar fizyczny o około 50% większy niż wymiary pojedynczej komórki biologicznej.
Zależność między numerem wiersza konkretnego obrazu z mapowania liniowego a długością fali powinna zostać wykorzystana do rekonstrukcji obrazów w celu uzyskania wielu map intensywności fluorescencji wzbudzonej przy różnych długościach fal. Aby uzyskać obraz emisji fluorescencji dla konkretnej długości fali, należy znaleźć numer wiersza na obrazie uzyskanym z pierwszego mapowania liniowego, który odpowiada tej długości fali. Następnie sąsiedni wiersz w kolejnym obrazie z mapowania liniowego odpowiada następnemu wierszowi obrazu emisji fluorescencji.
Dla danej długości fali należy zestawić wszystkie wiersze obrazów odpowiadające tej długości, aby uzyskać przestrzenne mapy intensywności fluorescencji XY próbki przy tej długości fali. Powtórz tę procedurę dla wszystkich pozostałych dostępnych długości fal, aby zebrać dane dotyczące próbek. W pierwszej kolejności wyjmij z inkubatora płytki z koloniami transformowanych drożdży.
Powinny wystąpić co najmniej trzy typy przekształconych komórek. Komórki wykazujące ekspresję białek docelowych znakowanych oboma rodzajami sond fluorescencyjnych, komórki wykazujące ekspresję wyłącznie białek znakowanych sondami fluorescencyjnymi donora oraz komórki wykazujące ekspresję wyłącznie białek znakowanych sondami fluorescencyjnymi akceptora.
Do probówki do mikrocentryfugi dodać 100 µL 100 mM chlorku potasu. Następnie, używając końcówki do mikropipety, pobrać od trzech do pięciu kolonii drożdży z płytki z komórkami wykazującymi ekspresję białek znakowanych zarówno sondą donora, jak i akceptora fluorescencji, i zaszczepić je w 100 mM chlorku potasu. Z tak przygotowanych komórek pobrać 10 µL zawiesiny komórkowej i nanieść na nowe szkiełko przedmiotowe.
Przykryj kroplę szkiełkiem podstawowym i nanieś kroplę olejku na powierzchnię szkiełka. Następnie ręcznie zamknij migawkę na drodze wiązki lasera, aby zablokować dopływ światła laserowego do obiektywu mikroskopu. Przymocuj preparat do stolika translacyjnego XY, Z i przesuń stolik wzdłuż osi optycznej, aż obiektyw mikroskopu zetknie się z kroplą olejku imersyjnego.
Teraz włącz oświetlenie szerokopolowe i przejdź do ustawień kamery. Tryb zbierania danych: wideo. Obraz szerokopolowy próbki będzie silnie rozmyty ze względu na obecność kratki transmisyjnej w torze emisji.
Należy zatem umieścić filtr pasmowy o małej szerokości połówkowej (FWHM) w torze optycznym przed siatką transmisyjną. Powoli przesuwaj stolik translacyjny w kierunku osi optycznej, obserwując obraz komórek na ekranie kamery, aż komórki zostaną ustawione w ostrości. Przesuń stolik w kierunku X lub Y, aby umieścić pojedynczą komórkę w punkcie ogniskowania wiązki lasera.
Wyłącz źródło oświetlenia szerokopolowego i usuń filtr pasmowy z toru emisji. Odblokuj wiązkę lasera na krótki czas, jednocześnie obserwując sygnał odbierany przez matrycę CCD. Jeśli w czasie padania wiązki lasera na komórkę na matrycy CCD zostanie wykryty sygnał fluorescencji, przeprowadź pełny skan akwizycji danych fluorescencyjnych dla tej komórki.
Kluczowe jest zastosowanie tych samych parametrów skanowania, a w szczególności liczby linii oraz przyrostu Y, określonych w wcześniej zaprezentowanej procedurze kalibracji. Należy powtórzyć proces lokalizacji komórek i pozyskiwania danych fluorescencyjnych dla dużej liczby komórek wykazujących ekspresję białek sprzężonych zarówno z tagami donorowymi, jak i akceptorowymi. Po zgromadzeniu wystarczającej liczby obrazów fluorescencyjnych komórek z białkami znakowanymi oboma receptorami, należy powtórzyć cały proces zarówno dla komórek wykazujących ekspresję wyłącznie białek znakowanych donorowymi sondami fluorescencyjnymi, jak i dla komórek wykazujących ekspresję wyłącznie białek znakowanych akceptorowymi sondami fluorescencyjnymi.
Na koniec należy zrekonstruować wszystkie skany, aby uzyskać przestrzenne mapy intensywności fluorescencji XY z rozdzielczością spektralną dla każdego zestawu danych, stosując procedurę opisaną wcześniej. Na tych trzech rysunkach przedstawiono wynikowe mapy przestrzenne obliczone na podstawie pomiarów dwufotonowej mikroskopii z rozdzielczością spektralną, wykonanych na komórce drożdży wykazującej ekspresję receptora czynnika ste-2 do alpha. Dwuwymiarowe mapy sygnałów donora i akceptora uzyskano poprzez analizę profili emisji spektralnej pobranych z każdego miejsca w komórce.
Intensywności fluorescencji są przypisane do kolorów sztucznych zgodnie z ich wartościami, a skala jest przedstawiona jako wstawka. Następnie, wykorzystując obrazy KDA i KAD, obliczono dwuwymiarową mapę pozornych wydajności FRET, używając wartości wyodrębnionych z mapy pozornych wydajności FRET komórki pokazanej przed chwilą, po czym przygotowano wykres histogramu. Zmierzone wartości EAPP komórki są przedstawione za pomocą okręgów.
Czerwona linia ciągła reprezentuje dopasowanie do danych pomiarowych z wykorzystaniem sumy poszczególnych funkcji wapnia przedstawionych przez zielone linie ciągłe. Analiza histogramu, opisana w tekście protokołu, potwierdza, że sterylny kompleks ligandu receptora czynnika alfa 2 przyjmuje w warunkach in vivo formę tetrameru o kształcie RBA. Po opanowaniu technika ta może zostać przeprowadzona w ciągu 12 godzin, pod warunkiem prawidłowego wykonania.
Podczas przeprowadzania tego eksperymentu ważne jest utrzymanie niskiej mocy źródła wzbudzenia. Należy unikać wielokrotnego wzbudzania donora przez pojedynczy impuls.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
W niniejszym badaniu wykorzystano system obrazowania z mikroskopii dwufotonowej z rozdzielczością spektralną w celu uzyskania map wydajności transferu energii rezonansowej Förstera (FRET) na poziomie pikseli w komórkach wykazujących ekspresję receptorów błonowych. Mapy wydajności FRET umożliwiają oszacowanie informacji stechiometrycznych dotyczących badanych kompleksów oligomerycznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biofizyka
- Biologia komórki
Wstęp
- Przeniesienie energii rezonansowej Förstera (FRET) jest potężną techniką badania oddziaływań białkowych.
- Zrozumienie stechiometrii kompleksów białkowych jest kluczowe dla wyjaśnienia ich funkcji.
- Mikroskopia dwufotonowa umożliwia obrazowanie głębokich tkanek przy minimalnym uszkodzeniu fotochemicznym.
- Genetycznie zmodyfikowane komórki mogą eksprimować specyficzne białka znakowane sondami fluorescencyjnymi do analizy FRET.
Cel badania
- W celu określenia informacji stechiometrycznych i strukturalnych dotyczących kompleksów białkowych.
- W celu zbadania powstawania kompleksów homo-oligomerycznych w żywych komórkach.
- W celu pogłębienia zrozumienia oddziaływań receptorowych na poziomie komórkowym.
Zastosowane metody
- Inżynieria genetyczna komórek drożdży w celu ekspresji białek docelowych z sondami fluorescencyjnymi.
- Wzbudzanie sond donora za pomocą impulsowego lasera bliskiej podczerwieni.
- Rozdział emisji fluorescencyjnych na komponenty spektralne przy użyciu siatki transmisyjnej.
- Projekcja danych spektralnych na matrycę CCD z mnożeniem elektronów w celu przeprowadzenia analizy.
Główne wyniki
- Pomyślnie wygenerowano mapy wydajności FRET na poziomie pikseli.
- Na podstawie map FRET oszacowano informacje stechiometryczne dotyczące kompleksów oligomerycznych.
- Zastosowana metodologia wykazała skuteczność w obrazowaniu żywych komórek biologicznych.
- Uzyskano wgląd w interakcje receptorów błonowych.
Wnioski
- Badanie przedstawia nowatorskie podejście do analizy oddziaływań białkowych w żywych komórkach.
- Obrazowanie FRET może ujawnić istotne szczegóły dotyczące tworzenia kompleksów receptorowych.
- Technika ta znajduje potencjalne zastosowania w zrozumieniu różnych procesów biologicznych.
Najczęściej Zadawane Pytania
Znaczenie dla przemysłu
Metoda ta umożliwia ilościowe określenie oddziaływań białko-białko na poziomie pojedynczych pikseli w żywych komórkach przy użyciu spektroskopowej mikroskopii dwufotonowej, zapewniając wgląd w stechiometrię i strukturę kompleksów oligomerycznych. Dzięki rejestracji pełnych danych spektralnych w jednym skanie, metoda ta redukuje artefakty czasowe wynikające z dynamiki molekularnej podczas akwizycji, co zwiększa niezawodność danych w procesie walidacji celu. Podejście to wspiera redukcję ryzyka mechanistycznego we wczesnej fazie odkrywania leków poprzez wyjaśnienie stanów oligomeryzacji receptorów, co zwiększa pewność predykcyjną w późniejszych etapach przesiewania i identyfikacji związków wiodących.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Pozwala na weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez określanie wielkości i konfiguracji oligomerów receptorów błonowych, takich jak GPCR, in vivo.
- Wartość operacyjna: Umożliwia ograniczanie ryzyka biologicznego dzięki bezpośredniej wizualizacji złożonej stechiometrii, co zmniejsza niejednoznaczność w mechanizmie działania celu.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfolio poprzez dostarczanie ilościowych, rozdzielczych przestrzennie map wydajności FRET, które korelują z funkcjonalnymi stanami receptorów.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych wykazujących ekspresję znaczników receptorowych do późniejszego przesiewu związków z określonymi liniami bazowymi interakcji.
- Wynik ilościowy: Generowanie pomiarów wydajności FRET na poziomie pikseli, co umożliwia powtarzalne, rozdzielone spektralnie odczyty w celu standaryzacji analizy.
- Ponowne wykorzystanie platformy: Ułatwienie skalowalnych procesów obrazowania stosowalnych do każdego białka z markerem fluorescencyjnym, co wspiera ponowne wykorzystanie aparatury w różnych projektach.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla chorób: Wykorzystanie receptorów sterylnego faktora 2 α ekspresowanych w drożdżach jako modelu oligomeryzacji GPCR, co jest zgodne z badaniami translacyjnymi funkcji receptorów w kontekstach zbliżonych do naturalnych.
- Ciągłość mechanistyczna: Stanowi pomost między etapem odkrywania a walidacją przedkliniczną poprzez powiązanie struktury oligomeru z funkcją komórkową, co wspiera decyzje o dalszym rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka.
- Zgodność z biomarkerami: Umożliwia korelację stanów oddziaływania z sygnalizacją w dół, co dostarcza informacji dla przedklinicznych modeli stratyfikowanych według biomarkerów.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum odkrywania leków – od walidacji celu, przez opracowanie testów, aż po walidację przedkliniczną – dostarczając danych o oddziaływaniach z rozdzielczością przestrzenną, co wspomaga identyfikację związków wiodących oraz dalsze badania mechanistyczne.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez rozstrzyganie stanów oligomeryzacji GPCR w żywych komórkach, co zmniejsza niepewność mechanistyczną.
- Screening: Dostarcza gotowe do analizy, powtarzalne mapy fluorescencji z ilościowymi wynikami FRET, umożliwiając wiarygodny screening związków w odniesieniu do zdefiniowanych linii bazowych oddziaływań.
- Analityka: Zapewnia rozdzielanie widm (spectral unmixing) oraz analizę wydajności FRET w oparciu o histogramy, co pozwala na ilościowe porównania między różnymi warunkami w celu optymalizacji związków wiodących.
- Badania translacyjne: Łączy strukturę oligomeru z funkcją w systemie istotnym dla danej choroby, wspierając dopasowanie biomarkerów i ciągłość badań przedklinicznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia wielokrotnie wykorzystywalną zdolność obrazowania do badania dowolnego białka znakowanego fluorescencyjnie w żywych komórkach, maksymalizując użyteczność platformy w różnych projektach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celu poprzez zmniejszenie niejednoznaczności mechanistycznej w oligomeryzacji receptorów.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację i powtarzalność dzięki jednorazowemu skanowi pozyskiwania widma, co minimalizuje zmienność czasową.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji typu go/no-go, dostarczając wglądów strukturalnych, które redukują ryzyko biologiczne na późnych etapach rozwoju leków.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko w oparciu o zwalidowaną stechiometrię oddziaływań i konfigurację kompleksu.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie mikroskopii fluorescencyjnej, rozdzielania widmowego (spectral unmixing) oraz teorii FRET w celu dokładnej interpretacji danych.
- Zależne od zastosowania dwufotonowego mikroskopu z rozdzielczością spektralną, wyposażonego w siatkę transmisyjną, detektor EMCCD oraz możliwości kalibracji lasera.
- Wymaga standaryzacji przygotowania komórek, protokołów znakowania i parametrów obrazowania pomiędzy zespołami w celu uzyskania powtarzalnych wyników.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania metody przy przejściu z drożdży na systemy komórek ssaczych lub pierwotnych ze względu na różnice w ekspresji i obrazowaniu.
- Ograniczone koniecznością optymalnego doboru par fluoroforów i zapewnienia separacji spektralnej, aby uniknąć przesączania się sygnału (bleed-through) w pomiarach FRET.
