Metody manipulacji eksperymentalnych po przecięciu nerwu wzrokowego w ośrodkowym układzie nerwowym ssaków

Komórki zwojowe siatkówki (RGC) to neurony ośrodkowego układu nerwowego, które przekazują informacje wizualne z siatkówki do mózgu za pośrednictwem nerwu wzrokowego. W towarzyszącym filmie zaprezentowano metodę eksodonizacji, czyli przecinania aksonów całej populacji RGC, jako model apoptycznej śmierci komórek nerwowych w dorosłym ośrodkowym układzie nerwowym. W niniejszym materiale metoda ta została połączona z procedurami bezpośredniego dostarczania czynników neurotroficznych, krótkich interferujących RNA, plazmidów lub wektorów wirusowych kodujących białka anty-ATO do uszkodzonych komórek zwojowych siatkówki lub do siatkówki w celu oddziaływania na nią w sposób globalny.

Aparat do iniekcji wewnątrzgałkowych zostaje zmontowany i wykorzystany do wstrzykiwania substancji do komory ciała szklistego oka w celu ukierunkowanego oddziaływania na komórki zwojowe siatkówki. Do wstrzykiwania substancji do nerwu wzrokowego stosuje się Gelfoam lub strzykawki Hamiltona. Wyniki obrazowania kikuta wskazują, że przeżywalność komórek zwojowych siatkówki może zostać zwiększona poprzez podanie czynników antyapoptotycznych.

Wykorzystując te techniki, niniejszą metodę można zastosować do identyfikacji białek zaangażowanych w apoptozę dojrzałych neuronów w ośrodkowym układzie nerwowym. Znaczenie tej techniki rozciąga się na terapię lub diagnostykę chorób ośrodkowego układu nerwowego, ponieważ przecięcie nerwu wzrokowego jest powtarzalnym modelem apoptozy neuronalnej w dorosłym OUN. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą techniką napotykają trudności, ponieważ uszkadzają soczewkę podczas wprowadzania szklanej pipety do komory ciała szklistego oka. Aby przygotować system strzykawkowy do iniekcji wewnątrzgałkowych, należy zacząć od usunięcia każdej igły lub nakrętki RN.

Przygotuj strzykawkę Hamiltona 1701 o objętości 10 µL z uszczelnieniem RN. Włóż pierścień PFA do gniazda pierścienia w złączce zaciskowej. Następnie wprowadź całą złączkę do końcówki strzykawki i lekko przykręć nakrętkę RN na górze.

Wsuń jeden koniec rurki PEEK o średnicy 1/16 cala do złączki zaciskowej przez otwór w nakrętce RN. Upewnij się, że rurka PEEK jest całkowicie osadzona. Dokręć nakrętkę RN, aby ścisnąć pierścień zaciskowy, co uszczelni rurkę PEEK.

Powtórz ten proces na obu końcach szklanego łącznika podwójnego RN. Przymocuj wolny koniec rurki szczytowej do jednego końca szklanego łącznika podwójnego RN, dokręcając nakrętkę RN. Szklana mikropipeta będzie stanowić igłę i cylinder systemu wtryskowego.

Wprowadź szklaną pipetę do wolnego końca podwójnego szklanego łącznika RN. Dokręć nakrętkę RN, aby unieruchomić pipetę. Pod mikroskopem stereoskopowym uformuj końcówkę o odpowiedniej średnicy, trzymając dociągniętą mikropipetę pod kątem i pocierając jej czubek o matową powierzchnię szkiełka przedmiotowego, aby doprowadzić do pęknięcia.

W idealnym przypadku końcówka powinna być lekko ścięta. Następnie, używając zestawu do przygotowania (priming kit) firmy Hamilton Syringe Company, należy napełnić strzykawkę, łącznik rurki szczytowej (peak tubing linker), szklany sprzęgacz podwójny RN oraz szklaną mikropipetę olejem mineralnym w celu przygotowania do użycia. W systemie wtrysku hydraulicznego należy zastąpić igłę igłą Hamilton 9 0 0 3 0.

Następnie na igłę Hamilton 9 0 0 3 0 nałóż gumowy septrum, aby zapewnić szczelność podczas wstrzykiwania oleju mineralnego. Wprowadź igłę Hamilton 9 0 0 3 0 strzykawki do odpowietrzania do tylnej części cylindra 10 µL strzykawki Hamilton systemu wtryskowego. Mocno dociśnij septrum do końca strzykawki, aby stworzyć szczelne połączenie.

Powoli naciśnij tłok, aby olej mineralny przepłynął przez szklane elementy systemu iniekcyjnego, wypełniając szklaną pipetę. Przepchnij cały olej przez system iniekcyjny, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza z całego toru przepływu.

Jeśli w strzykawce napełniającej kończy się olej mineralny, powoli wycofuj igłę, stale dozując olej. Aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza, napełnij ponownie strzykawkę do odpowietrzania i powtórz iniekcję. Gdy cały system zostanie wypełniony olejem mineralnym, włóż oryginalny tłok strzykawki 10 µL.

W strzykawce Hamiltona całkowicie wciśnij tłok, aby usunąć nadmiar oleju mineralnego z układu. Przetrzyj do czysta szklaną mikropipetę oraz koniec strzykawki. Za pomocą 70% etanolu wycofaj tłok do oznaczenia 2 µL na korpusie.

Koniec szklanej mikropipety wypełni się powietrzem, co zapewni strefę buforową między olejem mineralnym a wstrzykiwanym płynem. Należy napełnić cylinder pipety, umieszczając koniec mikropipety w odpowiednim roztworze i wycofując tłok strzykawki Hamiltona. Do oka dorosłego szczura w celu wykonania iniekcji wewnątrzgałkowej wstrzykuje się nie więcej niż 4–5 µL roztworu.

Zacznij od przełączenia przepływu gazu na maskę gazową przymocowaną do zestawu stereotaktycznego. Następnie umieść szczura znieczulonego izofluranem w aparacie stereotaktycznym. Zmniejsz stężenie izofluranu do 2% i monitoruj stan znieczulenia.

Przykryć zwierzę kocem chirurgicznym. Aby utrzymać temperaturę ciała podczas całej operacji, należy rozszerzyć powieki i nanieść jedną kroplę roztworu anestetyka. Iniekcja na powierzchnię rogówki wymaga udziału dwóch osób, z czego jedna wprowadza pipetę szklaną do komory ciała szklistego i utrzymuje jej pozycję.

Kolejną dłonią należy nacisnąć tłok strzykawki, aby podać pożądany roztwór. Pod mikroskopem chirurgicznym chwycić szklaną mikropipetę oraz podwójny szklany łącznik RN, a następnie rozsunąć powieki, tworząc kształt litery V naprzeciwko miejsca wstrzyknięcia. Przy pomocy palców oko zostanie uniesione z oczodołu. Delikatnie wprowadzić końcówkę szklanej mikropipety w obszarze pozbawionym naczyń krwionośnych i przez twardówkę pod kątem skierowanym w dół.

W momencie przebicia twardówki pipetą wyczuwalne będzie lekkie kliknięcie. Osoba trzymająca strzykawkę powinna teraz wstrzyknąć 4 µL roztworu, dociskając tłok do oznaczenia 2 µL na strzykawce. Iniekcja powinna trwać około jednej do dwóch sekund.

Pomyślnie wstrzyknięty roztwór przepłucze komorę ciała szklistego; należy utrzymać mikro pipetę w bezruchu przez około pięć sekund, a następnie wycofać ją w tym samym kierunku, w którym została wprowadzona igła. Spojówka przylegnie z powrotem do niewielkiego otworu, pomagając uszczelnić nakłucie twardówki. Po zakończeniu zabiegu należy wyłączyć izofluran i pozwolić zwierzęciu oddychać tlenem przez kilka minut. W celu zapobiegania wysychaniu rogówki podczas rekonwalescencji, należy pokryć jej powierzchnię maścią okulistyczną, a następnie wyjąć zwierzę z urządzenia stereotaktycznego i umieścić je w klatce rekonwalescencyjnej.

Aby manipulować komórkami zwojowymi siatkówki poprzez transport wsteczny po przeprowadzeniu ekotomii, należy najpierw wykonać przecięcie nerwu wzrokowego zgodnie z instrukcjami zawartymi w towarzyszącym filmie dotyczącym protokołu przecięcia nerwu wzrokowego, 2, 2 4, 1 znaczników i leków. Plazmidy, siRNA lub wektory wirusowe można aplikować do kikutu nerwu wzrokowego.

Istnieją dwie główne metody przeprowadzenia tej procedury: z wykorzystaniem gąbki żelowej (gel foam) lub poprzez bezpośrednią iniekcję do nerwu wzrokowego. W przypadku zastosowania metody z gąbką żelową należy upewnić się, że komórki zwojowe siatkówki zostały uprzednio oznakowane poprzez wstrzyknięcie znaczników retrogradnych do wzgórza górnego na tydzień przed taksonomią. Bezpośrednio po przecięciu nerwu wzrokowego należy umieścić mały fragment gąbki żelowej nasączonej roztworem eksperymentalnym na przekrojonym kikutcie nerwu wzrokowego, a następnie przywrócić zawartość oczodołu na poprzednią pozycję.

Po przywróceniu oka do pozycji neutralnej, za pomocą pęsety wciśnij kawałek gąbki żelowej do oczodołu, upewniając się, że pozostaje ona nad końcem nerwu wzrokowego. Technika iniekcji jest skuteczniejsza w przypadku podawania substancji, które muszą przedostać się do cytoplazmy aksonu, aby zostać przetransportowane wstecznie przez przepływ cytoplazmatyczny. Do wstrzyknięcia pożądanego roztworu do przeciętego nerwu wzrokowego używa się szczelnej strzykawki Hamiltona o pojemności 10 µL. Zaleca się stosowanie igły z krótkim ścięciem.

Napełnij strzykawkę 10 µL roztworu przeznaczonego do wstrzyknięcia. Zazwyczaj są to plazmidy irna lub wektory wirusowe. Chwyć krawędź nerwu wzrokowego za pomocą pęsety Dumont z cienkimi końcówkami. Wprowadź końcówkę igły do nerwu wzrokowego, równolegle do przebiegu nerwu.

Aż do momentu, gdy ścięcie igły przestanie być widoczne, wprowadzona igła zostanie otoczona z każdej strony przez nerw. Po wprowadzeniu igły należy delikatnie ścisnąć boki nerwu pęsetą z cienką końcówką i wstrzyknąć jedną czwartą roztworu, obracając strzykawką. Obrót o jedną czwartą w prawo lub w lewo.

Powtarzaj te kroki aż do wykonania pełnego obrotu igły i wstrzyknięcia całej zawartości strzykawki. Wyjmij końcówkę strzykawki z nerwu. Pozostaw w obrębie oczodołu wszelki wstrzyknięty płyn, który cofnął się z nerwu, ponieważ utworzy on dodatkowy zbiornik ułatwiający wchłanianie przez zakończenia aksonów.

Przywróć zawartość oczodołu na jej pierwotne miejsce, zamknij ranę i pozwól zwierzęciu na rekonwalescencję. Po operacji zwierzęta powinny być przetrzymywane w oddzielnych klatkach. Leki przeciwbólowe pooperacyjne należy podawać zgodnie z wytycznymi właściwej jednostki opieki nad zwierzętami.

Po operacji należy uważnie monitorować stan zwierząt oraz osób odpowiedzialnych za ich opiekę. Jak pokazano w tym filmie, do komórek zwojowych siatkówki (RGC) można dotrzeć bezpośrednio, podając peptydy, leki, wektory, plazmidy lub siRNA do przekrojonego kikut nerwu wzrokowego. W tym reprezentatywnym przykładzie wykonano retrogradne znakowanie fluoro-goldem, a następnie niezwłocznie wstrzyknięto do nerwu wzrokowego peptydy znakowane SI three.

Następnie przeprowadzono obrazowanie siatkówki na żywo, aby zapobiec wymywaniu peptydów z tkanki podczas utrwalania; jak widać tutaj, znakowane SI three peptydy wstrzyknięte do nerwu wzrokowego zostały w sposób retrogradowy przetransportowane z powrotem do somatów RGC w siatkówce. W tym przykładzie do kikuta nerwu wzrokowego wstrzyknięto znakowane SI three siRNAs. Bezpośrednio po takotomii ponownie wykonano obrazowanie siatkówki na żywo; znakowane SI three siRNAs wstrzyknięte do nerwu wzrokowego zostały przetransportowane retrogradowo przez RG CS, co potwierdza ich kolokalizacja.

Po opanowaniu techniki wstecznego znakowania Fluoro-Gold, procedura ta może zostać wykonana w ciągu kilku sekund, jeśli jest przeprowadzona prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury należy zachować szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić soczewki. Należy pamiętać, że praca z cząsteczkami wirusowymi może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać instytucjonalnych wytycznych dotyczących pracy z materiałami biologicznymi.