Ilościowe oznaczanie synaps: test oparty na immunocytochemii do ilościowego oznaczania liczby synaps

Jednym z najważniejszych celów w neuronauce jest zrozumienie sygnałów molekularnych, które sterują wczesnymi etapami tworzenia synaps. W związku z tym niezbędne stało się opracowanie obiektywnych metod ilościowego określania zmian w łączności synaptycznej. Aby określić liczbę synaps w różnych preparatach eksperymentalnych, hodowlane neurony lub preparaty mrożonych przekrojów tkanki mózgowej barwi się selektywnymi markerami presynaptycznymi i postsynaptycznymi w celu znakowania punktów kontaktu synaptycznego między neuronami.

Następnie komórki lub tkankę obrazuje się za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, uzyskując obrazy 8-bitowe dla każdego z kanałów odpowiadających dwóm markerom immunohistochemicznym. Obrazy są analizowane przy użyciu programu Image J 1.29 z wtyczką puncta analyzer. Aby określić stopień kolokalizacji markerów presynaptycznych i postsynaptycznych, punkty kolokalizacji mogą zostać wykorzystane do wyznaczenia liczby synaps obecnych w preparacie.

Główną zaletą opisanej tutaj techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak mikroskopia elektronowa, jest to, że test synaptyczny umożliwia analizę o znacznie wyższej przepustowości oraz ilościowe określenie liczby synaps. Główne zastosowania tej techniki obejmują diagnostykę i terapię schorzeń klinicznych, takich jak choroba Alzheimera, epilepsja czy autyzm, w których nieprawidłowości w łączności synaptycznej są uznawane za podstawę rozwijającej się patologii. Technika ta może być wykorzystana do zidentyfikowania form interwencji, które mogą zredukować lub złagodzić deficyty w zdolności dotkniętych chorobą neuronów do tworzenia synaps między sobą.

Choć metoda ta jest przydatna do badania rozwoju mózgu, można ją również zastosować do innych organizmów modelowych lub układów narządowych, w których zamierza się badać lub kwantyfikować liczbę kontaktów międzykomórkowych, pod warunkiem możliwości selektywnego znakowania przeciwległych stron każdego miejsca kontaktu. Przygotować kultury neuronalne poprzez wysiewanie oczyszczonych z siatkówki szczura komórek zwojowych siatkówki, pobranych od zwierząt w fazie P5-P7, na szkiełka podstawowe pokryte poli-D-lizyną. W płytce 24-dołkowej komórki pozostawia się do wzrostu w temperaturze 37 °C przez okres od trzech do pięciu dni przed transfekcją.

Po transfekcji inkubuj komórki przez dodatkowe siedem do ośmiu dni, aby umożliwić rozwój synaps, gdy wysiane komórki osiągną odpowiedni stopień dojrzałości. Usuń pożywkę z dołków i dodaj do każdego z nich 500 µL podgrzanego do odpowiedniej temperatury 4% paraformaldehydu, pozostawiając je do utrwalenia na siedem minut. Po utrwaleniu w temperaturze pokojowej przemyj komórki trzy razy roztworem PBS.

Ważne jest, aby nie dopuścić do wyschnięcia komórek w dołkach. Po usunięciu buforu z dołka należy go bezzwłocznie zastąpić kolejnym buforem. Przygotować bufor blokujący zawierający 50% normal goat serum oraz 0,2% Triton X 100.

Po usunięciu PBS z każdej dołki, należy dodać 200 µL buforu blokującego do każdej z nich i inkubować przez 30 minut. W temperaturze pokojowej należy usunąć bufor blokujący i przepłukać trzy razy. Za pomocą PBS należy przygotować rozcieńczenie przeciwciała pierwszorzędowego w roztworze składającym się z 90% buforu do przeciwciał i 10% NGS, zawierającym wybraną parę przeciwciał presynaptycznych i postsynaptycznych.

W tym przypadku zastosowano przeciwciało królicze anty-synapsyna, marker presynaptyczny, oraz przeciwciało mysie anty-Homer, marker postsynaptyczny. Rozcieńczenia przeciwciał pierwszorzędowych należy wirować przez pięć minut z maksymalną prędkością w wirówce stołowej, aby usunąć wszelkie wytrącone przeciwciała, a następnie dodać 200 µL roztworu przeciwciała pierwszorzędowego do każdej studzienki. Płytkę należy umieścić w wilgotnej komorze, aby zapobiec wysychaniu roztworu pierwszorzędowego.

Inkubować przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza po inkubacji z przeciwciałem pierwszorzędowym. Przepłukać każdą dołkę trzy razy. Do PBS dodać 200 µL odpowiednich przeciwciał wtórnych, rozcieńczonych w stosunku 1:1000 w przygotowanym buforze do przeciwciał zawierającym 10% NGS.

Podobnie jak poprzednio, po inkubacji z przeciwciałami wtórnymi, umieść płytkę w komorze z nawilżaczem i inkubuj przez dwie godziny w temperaturze pokojowej w ciemności. Przepłucz każdą studnię od trzech do czterech razy roztworem PBS. Na szkiełko przedmiotowe nanieś kroplę medium montażowego Vector Shield z DPI.

Następnie odwróć szkiełko nakrywowe z komórkami i połóż je na kropli w celu zamontowania preparatu. Na koniec nanieś bezbarwny lakier do paznokci wokół krawędzi szkiełka nakrywy. Należy uważać, aby nie przesunąć ani nie poruszyć szkiełek nakrywowych podczas aplikacji.

Ponieważ proces ten usunie komórki, należy pozostawić preparaty do wyschnięcia przez co najmniej 30 minut w suchym i ciemnym miejscu. Obrazowanie wykonuje się za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu Zeiss Axio Imager wyposażonego w odpowiednie zestawy filtrów i obiektyw imersyjny 63x. Umieść na stoliku mikroskopu preparat zawierający komórki nietransfekowane.

Używając zestawu filtrów DPI do wizualizacji jąder komórkowych, należy wybrać komórki oddalone od najbliższych sąsiadów o co najmniej dwie średnice komórki. Zastosowanie DPI na tym etapie pomoże uniknąć błędu systematycznego i zapewni losowość wyboru komórek. Dla każdej wybranej komórki należy uzyskać obrazy 8-bitowe, korzystając z odpowiednich zestawów filtrów, w tym przypadku GFP oraz Texas Red.

Nałożony obraz w pseudokolorach powinien przedstawiać markery presynaptyczne i postsynaptyczne odpowiednio w kolorze czerwonym i zielonym. Następnie umieść na stoliku mikroskopu preparat zawierający przetransfekowane komórki. W tym przypadku komórki zostały przetransfekowane wektorem ekspresyjnym TD tomato.

Użyj tego znacznika, aby zaznaczyć komórki w taki sam sposób jak poprzednio. Dla każdej zaznaczonej komórki uzyskaj osiem obrazów wgłębień, korzystając z odpowiednich zestawów filtrów, w tym przypadku GFP, Texas Red oraz Sci five. Nałożony obraz pseudokolorowy powinien przedstawiać markery postsynaptyczne w kolorach czerwonym, zielonym i niebieskim.

W niniejszym przypadku program puncture analyzer jest wykorzystywany do kwantyfikacji kolokalizacji punktów synaptycznych. Wtyczka Puncta analyzer została napisana przez Barry'ego Walka i jest dostępna na żądanie w programie ImageJ 1.26. Otwórz jeden z zebranych obrazów.

Użyj narzędzia do zaznaczania kolistego, aby wybrać obszar o promieniu odpowiadającym mniej więcej średnicy jednej komórki wokół interesującego nas SOR. Po zaznaczeniu obszaru zainteresowania przejdź do menu wtyczek i wybierz puncture analyzer. W wyświetlonym oknie opcji analizy wybierz Red Channel oraz Green Channel. Następnie wybierz subtract background i ustaw plik wyników (results file).

Kliknij OK. Następnie określ lokalizację, w której zostaną zapisane wyniki. Wyniki te można wyeksportować do programu Excel w celu przeprowadzenia dalszej analizy w oknie, które się pojawi.

Następnie upewnij się, że wybrany jest promień toczącej się kulki równy 50 i odznacz opcję białego tła. Ta modyfikacja nie jest wymagana, lecz jest często preferowana przez użytkowników aplikacji. Aby przejść do wizualizacji, kliknij OK.

Pojawi się nowe okno wraz z maską odpowiadającą obrazowi kanału czerwonego. Dostosuj próg tak, aby czerwona maska jak najlepiej odpowiadała jak największej liczbie oddzielnych punktów nakłuć. Kliknij gotowe, nie wprowadzając przy tym zbyt dużego poziomu szumów.

Ustaw minimalny rozmiar punktu na cztery piksele. Nie zmieniaj niczego innego. Kliknij OK.

Powtórz poprzedni krok, tym razem dla kanału zielonego. Po wykonaniu tej operacji dla kanału zielonego wtyczka dostarczy ilościowe dane odpowiadające punktom (puncta) w każdym kanale oddzielnie oraz punktom kolokalizującym się w obu kanałach. Przedstawiony tutaj test synaps można zastosować do krioprzestrojów mózgu oraz do każdej innej tkanki układu nerwowego, takiej jak rdzeń kręgowy lub siatkówka.

Zakładając dostępność odpowiedniej pary markerów presynaptycznych i postsynaptycznych. Należy rozpocząć od pobrania tkanki mózgowej od myszy poddanej eutanazji poprzez upuszczenie krwi i perfuzję PBS. Cały mózg należy umieścić w 4% paraformaldehydzie w PBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza na noc, a następnie wyjąć następnego dnia.

Przepłucz mózg trzykrotnie w PBS. Poddaj mózg krioprotekcji, umieszczając go w 30% sacharozie w PBS.

Tkanka początkowo będzie unosić się na powierzchni; należy ją przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsius, aż opadnie na dno. W tym momencie kriotekcja jest zakończona. Następnie, w roztworze o proporcjach dwa do jednego, składającym się z 20% sucrose oraz OCT i PBS, należy zatopić mózg w pożądanej orientacji do dalszego cięcia.

Na przykład w płaszczyźnie strzałkowej lub czołowej. Następnie należy położyć płaską metalową powierzchnię na pojemniku z suchym lodem. Umieścić na niej zatopiony mózg w celu zamrożenia; po zamrożeniu przenieść mózg do woreczka do mrożenia i przechowywać w temperaturze -80 °C przez maksymalnie rok przed wykonaniem przekrojów.

Przy użyciu kriotomu wykonać skrawki tkanki o grubości od 12 do 16 mikronów i przenieść je na szkiełka przedmiotowe. Następnie osuszyć szkiełka, umieszczając je w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Potem wypłukać je trzykrotnie w roztworze PBS, aby usunąć resztki OCT.

Używa się pisaka parafinowego do stworzenia hydrofobowej bariery wokół szkiełka, a następnie nanosi się bufor blokujący na szkiełko, który dzięki krawędzi parafinowej nie spływa poza obszar roboczy. Szkiełka należy umieścić w 20% normalnej surowicy koziej w PBS na jedną godzinę w temperaturze pokojowej w celu blokowania, a następnie przenieść przekroje do przeciwciał pierwszorzędowych rozcieńczonych w PBS z 0,3% Tritonem i 10% normalną surowicą kozią.

W tym przypadku przeciwciało królika anty-PSD 95 jest używane do znakowania glutaminergicznych przedziałów postsynaptycznych, a przeciwciało świnki morskiej anty-vGluT2 do znakowania glutaminergicznych zakończeń presynaptycznych. Przechowuj preparaty w temperaturze 4 °C i inkubuj od 36 do 60 godzin. Po zakończeniu inkubacji usuń przeciwciało pierwszorzędowe, zanurzając preparaty trzy razy w PBS po 15 minut każdorazowo.

Po tym kroku należy zabezpieczyć preparaty przed bezpośrednim światłem. Nanieść przeciwciała wtórne rozcieńczone 1:200 w PBS z 0,3% tritonem i 10% normalnym surowicą kozą. W tym przypadku użyto przeciwciał kozich anty-świnka morska.

Użyto przeciwciał Alexa 488 oraz goat anti rabbit Alexa 594. Inkubować przez dwie godziny w temperaturze pokojowej w ciemności.

Przemyj preparaty, zanurzając je czterokrotnie w PBS po 15 minut each przed montowaniem. Dodaj małe krople medium montażowego vector shield za pomocą dappy i przykryj preparaty szkiełkami podstawowymi. Nałóż lakier do paznokci, aby zapobiec przesuwaniu się szkiełek.

Obrazowanie przekrojów tkankowych należy przeprowadzić przy użyciu mikroskopu konfokalnego z odpowiednimi laserami, stosując obiektyw imersyjny z olejkiem o powiększeniu 63x dla każdego obrazu przekroju; należy wykonać seryjne przekroje optyczne w odstępach 0,33 micron nad całkowitą głębokością pięciu micron, co daje łącznie 15 przekrojów optycznych. Należy zobrazować co najmniej trzy przekroje z każdego zwierzęcia i uwzględnić co najmniej trzy zwierzęta dla danej grupy eksperymentalnej. Należy wygenerować projekcje maksymalnej intensywności z grup trzech kolejnych przekrojów, co pozwoli uzyskać pięć projekcji reprezentujących każda głębokość jednego micron.

Wartości te określono ilościowo przy użyciu programu Image J, zgodnie z opisem dla RG Cs, stosując zmodyfikowany ROI w celu określenia liczby synaps utworzonych w nieobecności astrocytów. Immunochemię przeprowadzono na rozdzielonych rgc traktowanych podstawową pożywką wzrostową, wykorzystując przeciwciała przeciwko bassoon (kolor czerwony) oraz homer (kolor zielony), zgodnie z oczekiwaniami. Zaobserwowano bardzo mało punktów kolokalizacji synaptycznej. Aby określić wpływ cząsteczek wydzielanych przez astrocyty na liczbę synaps tworzonych in vitro, rozdzielone RG Cs traktowano co trzy dni pożywką warunkowaną z mysich astrocytów przez łącznie 12 dni, a następnie poddano barwieniu.

W tym neuronie widocznych było wiele synaps, lecz wkrótce są one pokazane na czerwono. Homer jest pokazany na zielono; dysocjowane RDC transfekowane cytoplazmatycznym Lee wykazującym ekspresję TD tomato były traktowane wyłącznie podłożem wzrostowym podstawowym. Synapsy nie są widoczne.

Pomidor TD widoczny jest na niebiesko, a synapsa na czerwono. Sygnał dla markeru postsynaptycznego homer, pokazanego na zielono, jest bardzo słaby. Gdy te same komórki są poddawane przewlekłemu traktowaniu medium warunkowanym przez astrocyty szczura, widocznych jest wiele synaps.

Na tym obrazie TD tomato jest zaznaczone na niebiesko, synapsyna na czerwono, a homer na zielono. Przedstawiono oczyszczoną komórkę RGC, która została poddana działaniu pożywki warunkowanej astrocytami i zbarwiona na czerwono dla markerów przedsynaptycznych oraz na zielono dla postsynaptycznych markerów homer; maski progowe wygenerowane za pomocą programu Puncta analyzer odpowiadają dwóm obecnym kanałom. Po zidentyfikowaniu punktów kolokalizacji program Puncta analyzer generuje graficzną reprezentację tych punktów.

Program puncta analyzer dostarcza wynik numeryczny wskazujący liczbę dyskretnych punktów (puncta) zidentyfikowanych w obu kanałach oraz w punktach kolokalizacji. Dane uzyskane z analizy tego neuronu ilustrują zdolność cząsteczek wydzielanych przez astrocyty do promowania tworzenia synaps; przedstawiono to tutaj jako test synaptyczny, w którym ilościowo określono kolokalizację immunohistochemicznego znakowania presynaptycznego i postsynaptycznego, aby wykazać potencjację indukowanego przez astrocyty tworzenia synaps poprzez nadekspresję neuronalnego receptora dla ważnej, wydzielanej przez astrocyty cząsteczki synaptogennej – trombospondyny. Na rysunku przedstawiono średnią liczbę synaps na neuron poddany przewlekłej inkubacji w podstawowej pożywce wzrostowej (gm) lub w pożywce warunkowanej astrocytami.

A-C-M-A-C-M silniej stymuluje tworzenie synaps w komórkach zwojowych siatkówki nadekspresujących receptor trombospondyny w porównaniu do komórek nadekspresujących pusty wektor. Aby określić gęstość synaptyczną w górnym wzgórzu myszy, przed- i postsynaptyczne przedziały zostały oddzielnie oznakowane przy użyciu specyficznych dla przedziałów markerów immunohistochemicznych. Jak tu pokazano, odnotowano wzrost liczby synaps od siódmego dnia po urodzeniu do P 14.

Ilustruje to wzrost liczby synaps w górnym wzgórzu w tym okresie rozwojowym. Po opanowaniu techniki protokół ten można zrealizować w ciągu około dwóch dni dla dysocjowanych kultur neuronalnych oraz w ciągu około pięciu dni dla przekrojów mózgu, pobranych od zwierzęcia zgodnie z tą procedurą. Inne metody, takie jak elektrofizjologia i mikroskopia elektronowa, są wykorzystywane do weryfikacji, czy zmiany w liczbie synaps odzwierciedlają odpowiednio zmiany w synapsach funkcjonalnych oraz w synapsach prawidłowych pod względem ultrastrukturalnym.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak zastosować immunohistochemię w przygotowaniu eksperymentalnym w celu określenia liczby synaps. Niniejszy protokół szczegółowo opisuje, jak wykorzystać przeciwciała specyficzne dla danych przedziałów, aby selektywnie znakować przedziały presynaptyczne i postsynaptyczne. W tym kontekście definiujemy synapsy jako punkty kolokalizacji sygnałów uzyskanych z każdego z tych markerów.