Analiza allelo-specyficznej ekspresji genów w celu zbadania funkcjonalnych podstaw powiązań genetycznych

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest sprawdzenie, czy dany wariant DNA, na przykład taki, który jest powiązany z chorobą, wpływa na ekspresję konkretnego genu. Osiąga się to poprzez wybór linii komórkowych heterozygotycznych zarówno pod względem tego wariantu, jak i polimorfizmu pojedynczego nukleotydu (snip) w kodującej części interesującego genu. W drugim kroku z komórek izoluje się DNA i RNA, które następnie służą jako matryca w reakcji allele-specyficznego przedłużania pierwszej sekwencji.

Następnie produkty pierwotnej elongacji są analizowane za pomocą spektrometrii mas w celu określenia względnej liczności dwóch alleli. Uzyskane wyniki pozwalają stwierdzić, czy pierwotny wariant DNA związany z chorobą wiąże się również z różnicą w ekspresji genu na podstawie ilościowych pomiarów allelo-specyficznych przy użyciu spektrometrii mas. Głównymi zaletami tej techniki są, w przeciwieństwie do testu z genem reporterowym lucyferazy, brak konieczności manipulacji molekularnych oraz możliwość pomiaru endogennych poziomów ekspresji genu.

Co więcej, jesteśmy w stanie porównać poziomy ekspresji obu alleli w sposób kontrolowany wewnętrznie, co eliminuje część zmienności eksperymentalnej. Metoda ta pomaga nam odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie genetyki człowieka, takie jak molekularne mechanizmy leżące u podstaw asocjacji genetycznych. Pomysł zastosowania tej metody pojawił się, gdy zidentyfikowaliśmy asocjację genetyczną obejmującą trzy geny i nie mogliśmy zawęzić sygnału do jednego z nich.

Poprzez dalsze mapowanie genetyczne. Komórki wykorzystane do tego testu powinny wykazywać ekspresję badanego genu, a także spełniać dwa podstawowe wymagania genotypowe. Muszą być heterozygotyczne zarówno w odniesieniu do sekwencji DNA związanych z chorobą, jak i markerów DNA, które pozwalają odróżnić transkrypty na podstawie ich pochodzenia chromosomalnego. W przedstawionej tutaj strategii wyboru linii komórkowych, linie A i B, A są heterozygotyczne dla transkrybowanego markera kodującego reprezentowanego przez trójkąty.

Linia Omnicell A jest jednak heterozygotyczna w odniesieniu do sekwencji DNA związanej z chorobą, nazywanej wariantem DNA ryzyka i reprezentowanej przez okręgi. Niebieski allel wariantu ryzyka wiąże się z niższym poziomem transkrypcji. Po wybraniu hodowli linii komórkowej w kolbie zgodnie ze specyfikacją dostawcy – w tym pokazie wykorzystamy fibroblasty – przygotuj dwie płytki Petriego o średnicy 10 centymetrów, odpowiednio do ekstrakcji DNA i RNA. Choć badanie to ma tak samo zastosowanie do innych typów komórek, w tym do komórek pierwotnych.

Gdy komórki osiągną 80% konfluencji, można je zebrać w celu ekstrakcji DNA i RNA, stosując standardowe metody, w tym dostępne komercyjnie zestawy odpowiednie dla wybranego typu komórek. Przed przeprowadzeniem tego testu zaprojektowano dwie pary starterów PCR dla każdego markera DNA: jedną parę do amplifikacji genomowego DNA oraz drugą do amplifikacji cDNA. Startery forward i reverse do amplifikacji cDNA należy umieścić w różnych eksonach, aby uniknąć kontaminacji genomowej. Startery powinny być zaprojektowane tak, aby uzyskać produkt PCR o długości od 100 do 500 par zasad dla każdej linii komórkowej. Dla każdej linii przygotowano reakcje PCR o objętości 80 µL: cztery niezależne reakcje dla amplifikacji genomowego DNA oraz cztery niezależne reakcje dla amplifikacji cDNA w każdym przypadku.

Mieszanina do reakcji PCR zawiera polimerazę DNA, NTP, primery, chlorek magnezu oraz genomowe DNA lub cDNA. Reakcje PCR należy przeprowadzić w warunkach zoptymalizowanych dla każdej pary primerów, utrzymując liczbę cykli w liniowej fazie amplifikacji. Po zakończeniu reakcji PCR należy usunąć primery PCR i nadmiar dNTP poprzez dodanie egzonukleazy I oraz krewetkowej fosfatazy alkalicznej SAP do każdego produktu PCR i inkubację w temperaturze 37 °C przez 20 minut, a następnie przez 15 minut w temperaturze 85 °C.

Nanieś każdy produkt PCR dwukrotnie na płytkę 384-dołkową, aby dla każdej próbki dostępne były osiem pomiarów. Łącznie 16 plamek dla głównego testu elongacji. Zaprojektuj starter elongacyjny za pomocą oprogramowania do projektowania testów w taki sposób, aby ten sam starter mógł być użyty zarówno dla produktów genomowych, jak i cDNA-PCR.

Określ długość starterów w zakresie od 14 do 18 par zasad. Przeprowadź pierwotną reakcję elongacji z zastosowaniem odpowiedniej mieszaniny trzech terminalnych deoksynukleotydów i jednego deoksynukleotydu. Typowa pierwotna reakcja elongacji obejmuje etap wstępny w temperaturze 94 °C przez dwie minuty, a następnie 40 cykli: 94 °C przez pięć sekund, 52 °C przez pięć sekund i 72 °C przez pięć sekund.

Na koniec wydłużone oligonukleotydy poddaje się kwantyfikacji za pomocą spektrometrii mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą macierzą z pomiarem czasu przelotu, wykorzystując spektrometr mas ze spektroczytaniem. Kluczowym punktem niniejszego protokołu jest zastosowanie kilku strategii kontroli szumu eksperymentalnego w celu wyeliminowania artefaktów. Niezwykle ważne jest powtórzenie eksperymentu co najmniej trzykrotnie.

Najlepszą kontrolą dla eksperymentu jest wykorzystanie linii komórkowej heterozygotycznej pod kątem analizy snip dla pierwszej ekstensji, która nie posiada jednak allelu związanego z chorobą. Dodatkowo należy opracować analizy dla alternatywnych markerów kodujących transkrybowane DNA. Jeśli nie są one dostępne, dodatkową kontrolę można zapewnić poprzez zastosowanie alternatywnych par starterów PCR celujących w różne eksony w analizie pierwszej ekstensji.

Kontrolę wewnętrzną można zapewnić poprzez zaprojektowanie starterów do elongacji i przyłączenie ich zarówno do nici forward, jak i reverse. Przedstawiono tutaj przykład analizy ekspresji specyficznej dla allelu wraz z przykładami śladów spektrometrii mas. Rysunek ten pokazuje wyniki analizy czterech produktów pierwotnej elongacji specyficznej dla allelu, przeprowadzonej na czterech różnych matrycach.

Dwa górne wykresy przedstawiają wyniki uzyskane z analizy genomowego DNA dwóch różnych linii komórkowych, z których obie są heterozygami pod względem transkrybowanego polimorfizmu kodującego. Jednak tylko linia komórkowa A jest heterozygota pod względem wariantu DNA zwiększającego ryzyko. Dwa dolne wykresy przedstawiają wyniki uzyskane z analizy cDNA wygenerowanego z tych samych linii komórkowych w wyniku artefaktu eksperymentalnego.

Pierwszy piki jest zawsze wyższy od drugiego, nawet w analizie genomicznej. Dlatego wyniki analizy genomicznej są wykorzystywane do normalizacji danych cDNA. Analiza statystyczna jest przeprowadzana poprzez wyodrębnienie pełnego raportu typowania ELO w oprogramowaniu typu mass array.

Niniejszy raport przedstawia dane dotyczące pola piku; pokazujemy tutaj przykład odnoszący się do dwóch linii komórkowych, komórki A i komórki B, heterozygotycznych pod kątem kodującego polimorfizmu pojedynczego nukleotydu (SNP), przy czym tylko komórka A jest heterozygotyczna pod kątem markera powiązanego z chorobą. Kolumny zaznaczone na szaro są generowane bezpośrednio przez oprogramowanie, natomiast kolumny zaznaczone na zielono są wyliczane ręcznie dla każdej komórki. Dla cDNA oraz genomowego DNA wykonano po osiem pomiarów.

Oprogramowanie obliczy pole pod każdym pikiem widma, co odpowiada liczebności każdego z dwóch alleli. Stosunek alleli jest obliczany poprzez podzielenie pola pierwszego allela przez pole drugiego allela dla każdej próbki cDNA i genomowej. Następnie obliczana jest średnia oraz błąd standardowy dla ośmiu pomiarów.

Wysoki błąd standardowy przekraczający 0.1 wskazuje na brak spójności pomiarów, które w takim przypadku należy odrzucić. Na koniec, średni stosunek cDNA jest normalizowany względem średniego stosunku genomowego DNA w celu oszacowania odchylenia od stosunku równego jedności, którego oczekuje się w sytuacji braku różnic w ekspresji specyficznej dla allelu. Ponieważ znormalizowany stosunek w komórce A różni się od jedności, natomiast w komórce B jest bliski jedności, dane sugerują, że linia komórkowa A posiada wariant DNA sprzężony z allelem mierzonym przez drugi piki, co obniża ekspresję analizowanego genu.

Linia komórkowa B stanowi bardzo wygodną kontrolę negatywną. Chociaż przeprowadzenie tej procedury jest niezwykle istotne dla zdefiniowania informatywnych wariantów genetycznych oraz odpowiednich kontroli eksperymentalnych, po zastosowaniu tej metody można wykorzystać inne podejścia, takie jak haplotypowa immunoprecypitacja chromatyny. Pomaga ona odpowiedzieć na pytania dotyczące wariantów genetycznych, dla których nie istnieją transkrybowane markery umożliwiające analizę allelowej specyficzności ekspresji genów.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak analizować RNA w sposób specyficzny dla allelu oraz jak wykorzystać tę metodę do zrozumienia funkcjonalnych wariantów o znaczeniu genetycznym.