Farmakologia behawioralna w klasycznym warunkowaniu odruchu wyciągania trąbka u pszczoły miodowej (Apis mellifera)
24 stycznia 2011
Prezentujemy sposób wdrożenia metody farmakologii behawioralnej w paradygmacie apetycyjnego warunkowania węchowego u pszczół miodnych (Apis mellifera) poprzez systemiczne podawanie leków. Metoda ta pozwala w prosty i niezawodny sposób badać mechanizmy leżące u podstaw uczenia się i tworzenia pamięci.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest zbadanie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw uczenia się i tworzenia pamięci. W przypadku pszczół miodnych pierwszym krokiem jest odłowienie latających pszczół z ula. Następnie pszczoły są przymocowywane do plastikowych rurek.
Trzecim krokiem procedury jest przeprowadzenie warunkowania klasycznego. Leki mogą być wstrzykiwane w określonych punktach czasowych wokół warunkowania w celu zbadania ich wpływu na proces uczenia się i formowania pamięci. Ostatnim krokiem procedury jest test retencji pamięci.
Ostatecznie zmiany w zachowaniu po podaniu leku mogą ujawnić molekularne mechanizmy leżące u podstaw uczenia się i formowania pamięci u pszczół miodnych. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie uczenia się i pamięci poprzez odkrycie molekularnych mechanizmów tworzenia pamięci.
Generalnie badacze rozpoczynający pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ czas prezentacji bodźców podczas warunkowania orazB przywoływania pamięci musi być precyzyjny. Kluczowy jest również reżim żywieniowy. Procedura zostanie zademonstrowana przez cutting gearing i Johannes faberg studentom studiów magisterskich i doktoranckim z mojego laboratorium. W dniu poprzedzającym eksperyment należy zebrać pszczoły między godziną 14:00 a 16:00, używając pleksiglasowej piramidy przepuszczającej światło UV.
Po powrocie do laboratorium ustaw piramidę na podstawie i przesłoń ściany ręcznikiem, pozostawiając wierzchołek odsłonięty. Otwórz wierzchołek i przytrzymaj szklaną fiolkę nad otworem, pozwalając pojedynczej pszczole wlecieć do fiolki, a następnie ponownie ją zamknij. Powtarzaj tę procedurę, aż wszystkie pszczoły zostaną przeniesione do szklanej fiolki jesienią i zimą.
Gdy pszczoły nie latają na zewnątrz, ul jest przechowywany w szklarni w siatce; pojedyncze pszczoły są wyłapywane bezpośrednio z siatki. Używając jednej fiolki szklanej na pszczołę, unieruchom pszczołę, chłodząc fiolkę na lodzie przez dwie i pół do trzech i pół minut. Uważnie monitoruj pszczołę i wyjmij ją z lodu natychmiast po zaprzestaniu ruchu.
Unieruchom pszczołę w małej plastikowej probówce za pomocą taśmy klejącej. Upewnij się, że pszczoła może swobodnie poruszać odwłokiem, ale nie głową, tułowiem ani odnóżami. Ważne jest również, aby nie uciskać szyi.
Po przygotowaniu pszczoły umieść probówkę w ponumerowanym otworze w statywie, aby ułatwić obsługę i identyfikację.
Probówki są zawsze zwracane do tego samego otworu w ziemi. Po manipulacji należy karmić pszczoły między godziną 16:00 a 18:00 w miejscu innym niż miejsce kondycjonowania. Wywołaj odruch wysuwania aparatury gębowej (PER), dotykając pszczół i ich czułków.
Przy użyciu roztworu sacharozy pozwól pszczole spożyć jedną kroplę roztworu SRA o objętości około 4 µL. Upewnij się, że nie zanieczyścisz czułków, proboscis lub plastikowej rurki pszczoły. Karm każdą pszczołę do momentu, aż przestanie przyjmować pokarm.
Wykaż szybki i wiarygodny odruch prostowania proboscis (PER), gdy ich czułki zostaną dotknięte roztworem. W kolejnych wieczorach eksperymentu karm każdą pszczołę cztery razy jedną kroplą roztworu sacharozy. Napełnij plastikową miseczkę o wysokości około 0,5 do 1 cm wodą z kranu.
Umieść kasetę z przymocowanymi pszczołami w misce, wykorzystując płytki lysa jako platformę. Przykryj miskę tekturą i przechowuj w temperaturze pokojowej przez noc. Warunkowanie węchowe pszczół odbywa się około godziny 10:00 rano dnia następnego po ich zebraniu.
30 minut przed rozpoczęciem eksperymentu. Umieść statyw z pszczołami w uprzężach w pobliżu miejsca warunkowania, ale z dala od otworu rury wylotowej, w której będą szkolone pszczoły. Następnie, pracując w dygestorium, przygotuj bodziec warunkujący.
Za pomocą końcówki z filtrem nanieś 4 µL olejku goździkowego na okrągły papier filtracyjny. Umieść nasączony papier filtracyjny w strzykawce o pojemności 20 mL i włóż tłok. Ustaw odtwarzacz audio, który będzie emitował sygnał akustyczny dla eksperymentatora.
Zapewnia to precyzyjny czas podaży bodźca, moment rozpoczęcia bodźca, moment zakończenia bodźca, czas trwania oraz miejsce aplikacji. Przygotuj się do rejestracji zachowania pszczoły podczas całego procesu warunkowania. Wynik pozytywny przyznaje się, jeśli pszczoła wysunie SSIS pomiędzy momentem rozpoczęcia bodźca warunkowego a prezentacją bodźca bezwarunkowego.
Przecięcie wirtualnej linii między otwartymi żuwaczkami. Aby rozpocząć próbę nabywania, należy wybrać pszczołę do treningu i umieścić ją przed wylotem przez 10 sekund. Krótko przed końcem tego dziesięciosekundowego odstępu należy umieścić strzykawkę zawierającą zapach w odległości trzech centymetrów od pszczoły i jej czułków. Zapach należy podawać przez pięć sekund, przepychając 20 milliliters powietrza przez strzykawkę.
Po trzech sekundach wprowadź bodziec bezwarunkowy, dotykając wilgotnym wykałaczką nasączoną roztworem sacharozy brzusznej części dystalnych flagell obu czułków. Uważając, aby nie nanieść roztworu na pszczoły i ich czułki, należy pozwolić pszczole polizać wykałaczkę. Ten złożony bodziec trwa cztery sekundy, po czym pszczoły są usuwane z kontekstu treningowego i umieszczane z powrotem w stojaku.
Jedna próba treningowa trwa 28 sekund, przy czym bodziec warunkowy jest prezentowany w 13 sekundzie. Po odstępie między próbami wynoszącym 10 minut należy zwrócić pszczołę do miejsca treningu. Przeprowadzić drugą z trzech prób w sposób opisany wcześniej, a następnie odczekać kolejne 10 minut przed wykonaniem ostatniego parowania.
Po zakończeniu treningu w danym dniu, umieść statywy z powrotem w misce. Pamiętaj, aby karmić każdą pszczołę cztery razy, podając jedną kroplę 4 µL roztworu sacharozy między godziną 16:00 a 18:00. Jak pokazano wcześniej, testy retencji można przeprowadzać w dowolnym odstępie czasu od kilku minut do kilku dni po treningu. Przygotuj test pamięci, umieszczając statyw z pszczołami w pobliżu miejsca warunkowania na 30 minut.
Rozpocznij testowanie, umieszczając pszczolę przed wylotem na 10 sekund. Przedstaw bodziec warunkujący przez pięć sekund i odnotuj wystąpienie PER. Po zakończeniu testów w danym dniu umieść statywy z powrotem w misce.
Należy pamiętać, aby każdą pszczołę karmić cztery razy, podając jedną kroplę 4 µL roztworu sacharozy między godziną 16:00 a 18:00, zgodnie z wcześniejszą demonstracją; na koniec całego eksperymentu należy zweryfikować, czy pszczoła nadal potrafi wysunąć proboscis, dotykając czułka roztworem SRA, aby mogła zostać uwzględniona w analizie. Pszczoły muszą przeżyć cały eksperyment i posiadać nienaruszoną PER. W niektórych badaniach w celu analizy wpływu interwencji farmakologicznych na pamięć węchową stosuje się iniekcje systemiczne. Iniekcje te mogą być podawane w różnych odstępach czasu, w zależności od projektu eksperymentu.
Na początek, za pomocą jednorazowej igły hipodermicznej, wykonaj niewielki otwór w kutykuli tylnej części S scootin w pobliżu szczeliny S scootle powyżej mięśnia lotnego. Następnie napełnij szklaną kapilarę jednym mikrolitrem roztworu do badania. Wprowadź kapilarę do otworu w kutykuli i wstrzyknij roztwór do mięśnia lotnego.
Przeszkoleni eksperymentatorzy są w stanie wstrzyknąć jedną dawkę B co 30 sekund, co pozwala na precyzyjne zsynchronizowanie czasu wstrzyknięcia i warunkowania. Przedstawiono tutaj dwa eksperymenty. Pierwszy eksperyment bada wpływ systemicznego wstrzyknięcia soli fizjologicznej przed treningiem na proces uczenia się pamięciowego.
W niniejszym badaniu wyodrębniono trzy grupy: grupę A, która nie otrzymała żadnego leczenia, grupę otrzymującą systemową iniekcję 1 µL soli fizjologicznej (PBS) oraz grupę pozorowaną (sham). Preparaty te podano na 30 minut przed treningiem przedstawionym tutaj po lewej stronie. Odsetek zwierząt wykazujących reakcję uwarunkowaną podczas nabywania wzorca wzrastał w ciągu trzech prób treningowych, przy czym nie stwierdzono różnic między grupami.
Wykresy słupkowe po prawej stronie pokazują, że ani wtryskiwanie PBS, ani pozorna lekcja nie wpłynęły na zapamiętywanie. W drugim eksperymencie, 24 godziny po treningu, iniekcje podano 40 minut po zakończeniu szkolenia; pszczoły podzielono na grupę otrzymującą sól fizjologiczną oraz grupę otrzymującą 1 µL inhibitora syntezy białek, anisomycyny. Wykresy słupkowe po prawej stronie wykazują wyraźny spadek zapamiętywania u pszczół otrzymujących anisomycynę. Wyniki te podkreślają znaczenie syntezy białek w tworzeniu pamięci węchowej.
Po przeprowadzeniu tej procedury można wykonać pomiary elektrofizjologiczne, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak: jakie są neurofizjologiczne podstawy uczenia się i formowania pamięci po ich rozwoju? Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie uczenia się i pamięci do zbadania molekularnych i neurofizjologicznych mechanizmów formowania pamięci u pszczoły miodnej.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia metodę farmakologii behawioralnej u pszczół miodnych (Apis mellifera), służącą do badania uczenia się oraz tworzenia pamięci poprzez podawanie leków. Metoda ta umożliwia rzetelne badanie mechanizmów leżących u podstaw tych procesów poznawczych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Farmakologia behawioralna
- Uczenie się i pamięć
- Warunkowanie węchowe
Wstęp
- Pszczoły miodne służą jako organizm modelowy do badania procesów poznawczych.
- Metoda ta wykorzystuje warunkowanie klasyczne do oceny retencji pamięci.
- Systemiczne podawanie leków może ujawnić molekularne mechanizmy uczenia się.
- Precyzyjny czas podawania bodźców jest kluczowy dla skutecznego warunkowania.
Cel badania
- Zbadanie wpływu środków farmakologicznych na uczenie się i pamięć pszczół miodnych.
- Zapewnienie niezawodnej metodologii dla badaczy w dziedzinie neuronauki behawioralnej.
- Ujawnienie molekularnych mechanizmów uczestniczących w tworzeniu pamięci.
Zastosowane metody
- Zbieranie i ujarzmienie latających pszczół miodnych.
- Warunkowanie klasyczne z wykorzystaniem bodźców zapachowych oraz sacharozy jako bodźca bezwarunkowego.
- Systemiczne podawanie leku w określonych punktach czasowych.
- Testy retencji pamięci przeprowadzone po warunkowaniu.
Główne wyniki
- Wykazano skuteczne warunkowanie i zapamiętywanie u pszczół miodowych.
- Zidentyfikowano wpływ zastosowania leków na zachowania uczenia się.
- Przedstawiono wnioski dotyczące harmonogramu i protokołów karmienia niezbędnych do efektywnego warunkowania.
- Ujawniono potencjalne mechanizmy molekularne leżące u podstaw tworzenia pamięci.
Wnioski
- Metoda ta jest skuteczna w badaniu uczenia się i pamięci u pszczół miodnych.
- Interwencje farmakologiczne mogą pomóc w wyjaśnieniu procesów poznawczych.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tej metodologii w celu zgłębienia dalszych zagadnień z zakresu neuronauki.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Farmakologia behawioralna z wykorzystaniem klasycznego warunkowania odruchu wyciągania trąbki (PER) u pszczół miodnych umożliwia precyzyjne badanie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw uczenia się i pamięci. Podejście to zapewnia solidny, ilościowy system oceny wpływu interwencji farmakologicznych na procesy poznawcze, wspierając wczesną walidację celów oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego w badaniach i rozwoju (R&D) skoncentrowanych na neurobiologii. Niezawodność i skalowalność tej metody czynią ją wartościową dla translacyjnych potoków badawczych dążących do uzyskania pewności prognostycznej w odniesieniu do celów molekularnych wpływających na formowanie się pamięci.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią weryfikację hipotez molekularnych związanych z uczeniem się i formowaniem pamięci.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez powiązanie interwencji farmakologicznej z wynikami behawioralnymi.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego dzięki kontrolowanym, ilościowym testom behawioralnym.
Przesiew i opracowanie analizy
- Zapewnia standaryzowany, powtarzalny test behawioralny do oceny wpływu związków na pamięć.
- Generuje ilościowe wyniki odpowiednie do analizy porównawczej między grupami eksperymentalnymi.
- Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszych etapów neurofarmakologicznych procesów przesiewowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje wyniki behawioralne z interwencjami molekularnymi, wspierając rozwój translacyjnych biomarkerów.
- Zapewnia ciągłość od mechanistycznych badań na etapie odkryć po przedkliniczną walidację celów poznawczych.
- Zmniejsza ryzyko biologiczne poprzez dostarczanie danych prognostycznych dotyczących molekularnych szlaków związanych z pamięcią.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum od etapu odkrycia do badań przedklinicznych, umożliwiając weryfikację hipotez dotyczących interwencji molekularnych w kontrolowanym systemie behawioralnym.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków dla celów związanych z pamięcią.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, ilościowe odczyty behawioralne do oceny związków.
- Analityka: Zapewnia mierzalne punkty końcowe do statystycznego porównania efektów leczenia.
- Badania translacyjne: Łączy studia nad mechanizmami molekularnymi z przedkliniczną walidacją behawioralną.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje platformę wielokrotnego użytku do różnorodnych badań neurofarmakologicznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w wyborze celu oraz zrozumienie mechanistyczne.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i przepustowość w badaniach z zakresu farmakologii behawioralnej.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie decyzji typu go/no-go poprzez powiązanie interwencji molekularnych z wynikami funkcjonalnymi.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację celów poznawczych i neurofarmakologicznych z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej w zakresie warunkowania behawioralnego oraz precyzyjnego określania czasu podawania bodźców.
- Wymaga specjalistycznego sprzętu do unieruchamiania, podawania leków i oceny behawioralnej.
- Wymaga rygorystycznej standaryzacji protokołów i analizy danych pomiędzy poszczególnymi zespołami.
- Możliwość adaptacji do różnych czynników farmakologicznych i projektów eksperymentalnych w ramach modelu PER.
- Poprawność włączenia danych zależy od przeżycia zwierzęcia oraz zachowania nienaruszonej odpowiedzi behawioralnej.
