Mikrokosmy z bloków agarowych do kontrolowanego rozkładu tkanek roślinnych przez grzyby tlenowe

Ogólnym celem niniejszej procedury jest inokulacja tlenowego grzyba degradującego drewno w mikrokozmosie w szalce Petriego, w którym wilgotność drewna i substraty egzogenne są ściśle kontrolowane. Osiąga się to poprzez najpierw przygotowanie mikrokosmosów z dokładnymi objętościami znanych mediów. Następnie drewno przeznaczone do degradacji oraz wszelkie egzogenne substraty stałe układa się na plastikowej siatce na powierzchni agaru, nie dopuszczając do kontaktu między substratami.

Następnie mikrokosmos zostaje zaszczepiony i inkubowany z badanym grzybem. Po inkubacji pobierane są bloki drewna w celu oznaczenia ubytku masy oraz przygotowania tkanek do analiz. W rezultacie można uzyskać dane wykazujące stopień biodegradacji drewna oraz rolę egzogennych źródeł pierwiastków poprzez pomiary ubytku masy, obserwacje morfologii grzybni oraz ukierunkowane analizy pierwiastkowe, takie jak spektroskopia z plazmą indukcyjnie sprzężoną.

Witajcie, nazywam się Brooke Jacobson i pracuję w laboratorium dr. Jonathana Schillinga w Katedrze Inżynierii Bioproduktów i Biosystemów na Uniwersytecie Minnesoty. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę wykorzystania szalek Petriego jako mikrośrodowisk do rozkładu tkanek roślinnych przez grzyby tlenowe. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania mechanizmów grzybowego rozkładu lignocelulozy.

Lignocelułoza to tkanka roślinna składająca się z ligniny, celulozy i hemicelulozy. Tkanką, którą najczęściej badamy, jest drewno; błędy związane z mniej technicznymi aspektami konstrukcji bloku świdra są najczęstszymi przyczynami niepowodzeń oraz głównym źródłem zmienności między badaniami, co sprawia, że publikacja wideo naszej konfiguracji bloku świdra jest przydatna. Z doświadczenia wiemy, że procedura ta pozwala uzyskać wyniki wysokiej jakości o niskiej zmienności.

Zacznijmy. W tych eksperymentach należy użyć szalek Petri, które są o jeden centymetr głębsze niż typowe szalki Petri, aby zwiększyć przestrzeń nad blokiem drewna w mikrokosmosie.

Rozpocznij przygotowanie mikrokosmosu, sporządzając odpowiednią ilość pożywki wolnej od wapnia i żelaza, w ilości 20 mililitrów na jedną płytkę Petriego. Wsyp 15 g agaru do kolby miarowej o pojemności 500 mililitrów, zawierającej około 400 mililitrów wody dejonizowanej z dodatkiem suplementów. Do mieszaniny dodaj mikroelementy, korzystając z wcześniej przygotowanych roztworów stokowych.

Po dodaniu składników odżywczych dopełnić kolbę miarową do kreski 500 ml. Następnie przenieść pożywkę do kolby o pojemności 1000 ml. Sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C i pod ciśnieniem 16 PSI przez 20 minut.

Należy uważać, aby nie przekroczyć objętości 500 mililitrów na kolbę, aby zapobiec zestaleniu się agaru przed naniesieniem go na płytki testowe. Po autoklawowaniu należy pozwolić pożywce ostygnąć do temperatury bezpiecznej w dotyku, aby zminimalizować kondensację. Minimalizacja wilgoci jest krytyczna w tych eksperymentach, podobnie jak zawartość wilgoci lub mc.

Wartość powyżej 80% spowoduje anoksję tkanek. Ogranicz rozkład spowodowany przez grzyby tlenowe i zwiększ zmienność jednorazowo. Schłodź. Użyj przenośnego pipetтора i sterylnych pipet polistyrenowych o pojemności 10 mililitrów, aby aseptycznie.

Przenieś agar na wysoki stos płytek w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Następnie docinij plastikowe siatki tak, aby pasowały do dna płytek. Po docięciu i dokładnym umyciu siatek wodą z mydłem, przygotuj je do wysuszenia i autoklawowania na potrzeby niniejszej demonstracji.

Do doświadczenia wykorzystano sosnę żółtą południową (SYP), ponieważ stanowi ona ważne źródło tarcicy. W budownictwie mieszkalnym w USA stosuje się tarcicę nieimpregnowaną; z jednego cięcia podłużnego wzdłuż słojów wycięto bloki o wymiarach 19 na 19 milimetrów, wolne od sęków. Następnie fragmenty te pocięto na sześcianowe bloki o boku 19 milimetrów.

Podziel bloki o wymiarach 19 mm³ na pół wzdłuż słojów, używając dłuta i młotka zamiast piły. Dzięki temu jedna krawędź bloku pozostanie szorstka i będzie przylegać do plastikowej siatki w mikrokosmosie bloku rolniczego, a górna krawędź będzie gładka, co ułatwi etykietowanie. Oznacz ołówkiem gładką krawędź bloków; przygotuj odpowiednią liczbę bloków dla wszystkich wariantów doświadczalnych, a także dla nieinokulowanych kontroli, które będą służyć zarówno do monitorowania kontaminacji, jak i jako próbki danych bazowych kondycjonowane równolegle w celu uzyskania materiału wysuszonego w piecu; umieść próbki w aluminiowych tackach i w piecu konwekcyjnym w temperaturze 100 °C przez 48 godzin.

Przenieść próbki z pieca do eksykatora w celu ich schłodzenia. Zważyć próbki, aby określić początkową masę suchej masy po suszeniu w piecu. Na koniec przygotować próbki, w tym siatki plastikowe i drewno, do autoklawowania, owijając je szczelnie folią, aby zminimalizować namaczanie.

Nie jest wymagane osobne pakowanie każdej próbki, jednak ekspozycja na parę musi być niewielka i jednolita. Próbki z etykietami należy autoklawować w temperaturze 121 °C i pod ciśnieniem 16 PSI przez jedną godzinę. W sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza należy przygotować puste AE, płytkę źródłową dla podłoża roślinnego z siatką inokulacyjną dla materiałów egzogennych, marker, paski paraformy, pęsetę oraz narzędzia do transferu.

Kolejnym krokiem szczepienia jest przeniesienie materiałów do szalek Petriego w celu zminimalizowania ryzyka kontaminacji. Narzędzia do przenoszenia oraz pęsety należy opalać nad płomieniem i odkażać 95% ethanol w miarę ich używania. W pierwszej kolejności umieść plastikową siatkę w szalce Petriego.

Następnie dodaj tutaj podłoże drewniane. Wzdłuż długości siatki dodaje się dwa drewniane bloki, aby można było sparować dane z wczesnych i późnych zbiorów. Bloki te są dodawane obok siebie, słojami skierowanymi w stronę źródła inokulum grzybowego.

Następnie dodaj materiały egzogenne. Tutaj badana jest rola gipsu w procesie rozkładu powodowanego przez grzyba nitkowatego. W związku z tym grzyb powinien zetknąć się z tymi krążkami gipsowymi przed dotarciem do drewna.

Pomiędzy każdym blokiem a punktem inokulacji na górze siatki umieszcza się jeden dysk gipsowy. Należy zadbać o to, aby dyski nie stykały się w drewnie, zachowując jednocześnie niewielkie odstępy między nimi. W celu przygotowania inokulum grzybowego należy użyć korkociągu Boer nr 4 o średnicy 7 mm, aby wyciąć krążki z dwutygodniowych kultur hodowanych w 20 ml agaru.

Pomaga to kontrolować objętość inokulum. W przypadku kontroli nieinokulowanych najlepiej dodać krążek z jałowej płytki. Należy nie dopuścić do kontaktu inokulum z substratami egzogenicznymi ani z drewnem, lecz umieścić je blisko siebie.

Użyj jednego krążka z inokulum na każdy blok. Uszczelnij szalki za pomocą parafilmu, który należy odciąć żyletką; trzymając płytki poziomo, owiń paradilm gładkim, ciągłym ruchem. Na koniec opisz pokrywki szalek markerem odpornym na alkohol, wpisując numery bloków bezpośrednio nad odpowiednimi podłożami.

Narysuj również okręgi na dyskach gipsowych. Ostrożnie przenieś płytki do inkubatora biologicznego, aby uniknąć wstrząśnięcia zawartości i zminimalizować kondensację wynikającą z wahań temperatury. Zastosowane tutaj warunki to 20 °C i ciemność; przeprowadź aseptycznie pobieranie próbek w serii czasowej, z wyjątkiem ostatniego zbioru.

W piątym tygodniu zbioru usuń całą partię badawczą. Spryskaj spód i wierzch każdej płytki 70% ethanol i za pomocą wysterylizowanych w ogniu pęsety usuń materiał wewnątrz komory bezpieczeństwa biologicznego. Przed zniszczeniem płytek rolniczych wykonaj zdjęcia, koncentrując się na wszelkich formach morph F lub melon.

Następnie wyjmij bloki przeznaczone do obróbki. Zroluj nadmiar pha, uważając jednak, aby nie zgubić żadnego zdegenerowanego materiału. Susz bloki w aluminiowych kuwetach i określ ubytek masy, wykorzystując wagę świeżą i suchą próbek kontrolnych, aby monitorować nadmierne odciąganie cieczy.

Dane dotyczące ubytku masy pomagają ocenić postępy rozkładu i stanowią istotne informacje. Jeśli stężenia pierwiastków mają być obliczone w przeliczeniu na masę gramową, dane procentowe muszą zostać znormalizowane. Na potrzeby statystyczne należy oznakować i monitorować wszystkie ciemnobrązowe bloki, które są wyraźnie nasiąknięte wodą.

Na koniec zutylizuj kultury w workach autoklawowalnych, zachowując plastikową siatkę wsporczą oraz wszelkie inne elementy, które można poddać recyklingowi do wykorzystania w przyszłych eksperymentach. W układzie mikrokozmosu z blokami rolniczymi bloki z drewna sosnowego spoczywały na plastikowej siatce, aby unieść bloki powyżej kontaktu z podłożem rolniczym. Okrągłe Crains rosły w bezpośrednim kontakcie z powierzchniami gipsowymi oraz w głąb bloków drewnianych.

Grzybnia ta stanowi istotne połączenie między drewnem a egzogennymi źródłami pierwiastków odżywczych. Kontrola tych egzogennych źródeł materiałów w agarze lub materiałach stałych jest kluczową zaletą projektu bloku agro w porównaniu z projektem bloku glebowego; przedstawiono tutaj średnią procentową utratę masy jako miarę stopnia rozkładu drewna przez ser crain po pięciu i 15 tygodniach inkubacji z sosną w mikrokosmosach bloków agro.

Nie stosowano żadnych zabiegów. Do agaru dodano pięć milimoli chlorku wapnia, a gips był czystszy niż 99% lub był to gips wzbogacony o 1% żelaza; w przypadku każdego zbioru słupki oznaczone tą samą literą nie wykazują istotnych różnic. Przy słupkach błędów reprezentujących odchylenie standardowe, w kontrolnych blokach sosny z brunatną zgnilizną zaobserwowano utratę masy powyżej 60%, co spełnia standard American Society for Testing and Materials zakładający rozkład powyżej 50%.

Średni współczynnik zmienności rozkładu w 16. tygodniu wyniósł 0,055. Poza niską zmiennością zaobserwowano efekt terapeutyczny. Rozkład grzybowy został zahamowany poprzez dodatek wapnia, zarówno w formie chlorku wapnia do agaru, jak i w postaci czystego gipsu.

Interesujące jest to, że tempo rozkładu wzrasta po dodaniu żelaza do gipsu. Sugeruje to, że kluczowym elementem w obserwowaniu pięciu powtórzeń w 15. tygodniu rozkładu jest żelazo, a nie wapń. W przypadku tego samego grzyba testowego powodującego brunatną zgniliznę, okrągłe blaszki, kolor grzybni ujawnia mein.

Różnice w zewnętrznych strzępkach między wariantami; bloki zostały usunięte i wysuszone. Wykazano brak grzybni w wariancie pozbawionym wapnia. Zaobserwowano żółknięcie w wariantach z czystym wapniem oraz rdzawy wygląd w wariancie z dodatkiem żelaza.

Grupa kontrolna stanowi niezaszczepione bloki służące do porównania. Co ciekawe, efekty główne zanikają przy zastosowaniu medium o wysokiej zawartości żelaza. Wraz sugeruje to, że grzyb ten wykorzystuje żelazo, a nie wapń.

W tych materiałach pokazaliśmy, jak wykorzystać układ z blokiem świdrowym do skutecznego badania biodegradacji tkanek roślinnych przez tlenowe grzyby nitkowate. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o zapobieganiu kontaktowi substratów ze sobą, zwłaszcza tkanki roślinnej ze świdrem, zminimalizowaniu zawartości wilgoci w świdrze oraz płytkach, a także dwukrotnym sprawdzeniu, czy zawartość każdej płytki nie przesunęła się przed inkubacją. Uwzględniając te zmienne, można znacznie lepiej kontrolować środowisko rozkładu niż w przypadku zastosowania układu z blokiem glebowym.

Można wygenerować dane z mocą statystyczną niezbędną do udzielenia odpowiedzi na postawione pytania badawcze. To wszystko. Dziękujemy za uwagę i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.