Krystalizacja białek do krystalografii rentgenowskiej

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wytworzenie kryształów białek do eksperymentów dyfrakcji rentgenowskiej. Przedstawiono trzy różne techniki przesiewania kryształów; opisano metody krystalizacji przez dyfuzję par, w tym metodę wiszącej kropli i siedzącej kropli, a także metody krystalizacji mikroprzepływowej (micro batch) dla krystalizacji przez dyfuzję par. Do studni wprowadza się czynnik wytrącający.

Następnie próbkę oczyszczonego białka o wysokim stężeniu miesza się z czynnikiem wytrącającym. Pomieszaną kroplę zamyka się w studzience zawierającej roztwór precypitantu. Krystalizacja metodą mikro-batch rozpoczyna się od wypełnienia studzienki olejem parafinowym.

Następnie białko jest naniesione do studni, a po nim roztwór wytrącający. Ostatnim etapem wszystkich metod jest doprowadzenie systemu do stanu równowagi oraz obserwacja pojawienia się i wzrostu kryształów wewnątrz kropel. Ostatecznie za pomocą tej techniki można uzyskać kryształy i wyznaczyć dyfraktogram białka, wykorzystując źródło promieni rentgenowskich z odpowiednim detektorem.

Cześć, jestem Sal z laboratorium profesora Yogi Motisa z Departamentu Biofizyki Molekularnej i Biochemii na Uniwersytecie Yale. Dzisiaj przedstawimy procedurę krystalizacji oczyszczonego białka. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania strukturalnych podstaw infekcji wirusowych.

Zacznijmy zatem od hodowli kryształów. Aby zidentyfikować metodę krystalizacji dla wybranej makrocząsteczki, wstępne badania przesiewowe można przeprowadzić przy użyciu dostępnych komercyjnie roztworów krystalizacyjnych, dobranych tak, aby wykorzystać metodę rzadkiej macierzy niepełnego planu czynnikowego w doborze warunków próbnych. Warunki te są wybierane na podstawie znanych i powszechnie skutecznych parametrów krystalizacji dla makrocząsteczek.

Po ustaleniu warunków krystalizacji można przygotować wąski screening, zmieniając stężenie czynnika wytrącającego oraz pH w obrębie pierwotnie otrzymanego wyniku. Zazwyczaj warunki krystalizacji stosowane w takich screeningach składają się z czynnika wytrącającego oraz buforu ustalającego pH; na potrzeby niniejszego pokazu wszystkie roztwory stokowe muszą zostać przefiltrowane przez filtr 0,22 mikrona. W procedurze wykorzystuje się wcześniej zidentyfikowane warunki krystalizacji dla lizosomów kurzych, stosując chlorek sodu jako czynnik wytrącający; należy rozpocząć od przygotowania jednofilarowych roztworów chlorku sodu o różnych stężeniach w 0,1 molarnej octanie sodu o różnych wartościach pH.

Następnie rozmrozić próbkę białka przechowywaną w temperaturze -80 °C i trzymać ją w lodzie. Typowe stężenia białek mieszczą się w zakresie od 5 do 50 mg/mL, przy czym wyższe stężenia zazwyczaj dają lepsze wyniki. W niniejszym doświadczeniu zastosowano roztwór lizozymu z jaja kurzego o stężeniu 50 mg/mL w 0,02 M octanie sodu o pH 4,9.

Wirować próbkę przez 15 minut przy 18 000 G i temperaturze czterech stopni Celsius, aby usunąć wszelkie częściowo zagregowane białka lub osad powstały podczas etapu rozmrażania. Agregaty te mogą zakłócać wzrost kryształów i sprzyjać dalszej agregacji. Po odwirowaniu.

Wyznacz stężenie białka na podstawie jego absorbancji przy 280 nanometrach za pomocą spektrofotometru UV. Stężenie białka można obliczyć z odczytu absorbancji oraz współczynnika ekstynkcji białka. Po przygotowaniu próbki białka, wypełnij 24-dołkową taczkę do krystalizacji metodą wiszącej kropli 500 µL roztworu precypitantu zgodnie z mapą tacek.

Wytwórz pierścień z smaru silikonowego wokół krawędzi każdej studni, nie zamykając go całkowicie, aby powietrze mogło uciekać z wnętrza studni. Oczyść szkiełko nakrywki za pomocą sprayu ze sprężonym powietrzem lub profesjonalnej ściereczki przeciwstatycznej, aby uniknąć kurzu, co ułatwi interpretację kropel krystalizacyjnych i wyeliminuje zanieczyszczenia. Kolejnym krokiem jest pipetowanie równych objętości próbki białka oraz roztworu z rezerwuaru na szkiełko nakrywki.

Można jednak przetestować różne objętości białka i precypitantu w ramach procesu optymalizacji; zastosowanie większej ilości białka niż precypitantu prowadzi do uzyskania określonego stężenia białka w zrównoważonej kropli, co może być pożądane w przypadku rzadkich próbek białka lub w celu spowolnienia nukleacji bądź wzrostu kryształów. W tej demonstracji na środku szkiełka nakrywkowe nanosi się 2 µL lizozymu o stężeniu 50 mg/mL w 0,02 M octanie sodu o pH 4, a następnie dodaje 2 µL roztworu krystalizacyjnego.

Podczas pipetowania białka i roztworu z rezerwuaru na szkiełko nakrywkowe należy zachować szczególną ostrożność, aby uniknąć powstawania pęcherzyków powietrza, co często zdarza się podczas wydmuchiwania powietrza z pipety. Należy delikatnie wymieszać kroplę, aby zapobiec przedwczesnemu wytrącaniu białka wynikającemu z lokalnie wysokich stężeń czynnika wytrącającego w kropli; mieszanie jest szczególnie istotne w przypadku lepkich czynników wytrcających, takich jak glikol polietylenowy, i powinno być wykonywane za pomocą pęsety. Delikatnie odwróć szkiełko nakrywkowe i połóż je na pierścieniu z smaru na górze dołka; wykonaj tę czynność kierunkowo, aby powietrze mogło wydostać się z dołka.

W przeciwnym razie powietrze może unieść szkiełko nakrywkowe, naruszając szczelność dołka. Przejdź do następnego dołka, aż cała tacka zostanie przygotowana. Po ustawieniu tacki przeprowadź jej inspekcję wizualną, usuwając cząsteczki kurzu i inne zanieczyszczenia, które mogą prowadzić do fałszywie dodatniej identyfikacji kryształów białka.

Użyj arkusza ocen do dokumentowania eksperymentu. Następnie umieść tacę w pożądanej temperaturze inkubacji, zazwyczaj między 4 °C a temperaturą pokojową. Najskuteczniejszą temperaturą jest 20 °C.

Należy zachować ostrożność podczas obchodzenia się z tacką i unikać wstrząsów, wibracji lub zmian temperatury podczas przenoszenia bądź inkubacji, ponieważ mogą one zapobiec wzrostowi kryształów lub negatywnie wpłynąć na ich jakość. Należy sprawdzać obecność kryształów w tace następnego dnia, a następnie co kilka dni, zawsze obchodząc się z tackami z należytą starannością. Wszelkie obserwacje oraz morfologię kropel należy odnotować w dedykowanym arkuszu ocen dla danej tacy.

Kryształy zazwyczaj pojawiają się od dwóch do pięciu dni, choć sporadycznie mogą pojawić się niemal natychmiast lub nawet po kilku miesiącach. Po zidentyfikowaniu warunków krystalizacji i poznaniu szybkości wzrostu kryształów, najlepiej pozostawić tacki niezakłócone, aż kryształy pojawią się i urosną do przynajmniej połowy ich końcowego rozmiaru. Pozostawienie tacek w spokoju może ograniczyć liczbę zdarzeń nukleacji kryształów, co skutkuje powstaniem mniejszej liczby większych kryształów. W przypadku krystalizacji metodą siedzącej kropli stosuje się tę samą procedurę co w metodzie wiszącej kropli, z wyjątkiem zastosowania tacki do siedzącej kropli z 24 dołkami, w której nie są wymagane szkiełka nakrywki.

Zamiast tego, dołka zawiera półkę, na której białko i czynnik wytrącający są mieszane pipetą; nanieś 2 µL roztworu lysozymu o stężeniu 50 mg/mL na środek półki, unikając powstawania pęcherzyków powietrza. Następnie, po przygotowaniu tacki, dodaj 2 µL roztworu czynnika wytracającego do próbki. Zamknij dołki taśmą optyczną w metodzie siedzącej kropli.

Szkiełka nakrywowe nie są wymagane. Kontynuuj inkubację i ocenę kryształów zgodnie z opisem dla metody wiszącej kropli. Aby przeprowadzić procedurę mikrobatch.

Przygotować roztwór do krystalizacji oraz białko zgodnie z opisem dla procedury wiszącej kropli. Pobrać nową tackę do metody mikrobatch oraz użyć sprężonego powietrza, aby uniknąć zanieczyszczenia tacki kurzem i innymi dużymi cząstkami. Do każdego dołka wlać olej parafinowy do głębokości 3 mm.

Następnie należy usunąć nadmiar oleju. Potem do wypełnionej wcześniej studni należy nanieść 1 µL roztworu białka, upewniając się, że kropla opadnie na dno studni. Następnie do studni należy nanieść 1 µL roztworu precypitantu.

Należy upewnić się, że kropla opadnie na dno studzienki i połączy się z kropelką białka. Przejdź do następnej studzienki, aż wypełnisz cały wsad, a następnie kontynuuj inkubację i analizę kryształów zgodnie z opisem. Typowe wyniki krystalizacji białek.

Przedstawiono wyniki doświadczeń. Wytrącanie amorficzne zachodzi, gdy białko i/lub czynnik wytrącający występują w wysokim stężeniu. Z kolei krople nienasycone zazwyczaj pozostają klarowne.

Rozdzielenie faz może wystąpić, jeśli białko lub detergent oddzielą się do innej fazy po zmieszaniu z określonymi precypitantami przy wysokim stężeniu. W optymalnych warunkach powinny powstać kryształy białka Arabidopsis csn. Siedem kryształów białka uzyskanych w glikolu polietylenowym 8, 000 i octanie magnezu ma kształt pręcikowy.

Przedstawione kryształy to również kryształy białek lizosomalnych, które otrzymano w roztworze jednego molowego chlorku sodu i octanu sodu o pH 4.9. Ten film poklatkowy demonstruje, że kryształy lizosomalne wyrastają w duże pryzmaty w ciągu kilku godzin od przygotowania próbek z zastosowaniem metody wiszącej kropli.

Właśnie pokazaliśmy, jak przygotować eksperyment z białkami podczas wykonywania tej procedury. Ważne jest, aby pracować w środowisku ze stabilną kontrolą temperatury i wilgotności, ponieważ wysoka wilgotność pomaga zminimalizować odparowywanie kropli; należy starać się stosować technikę, która ogranicza ekspozycję kropli na powietrze. Z tego powodu niezbędne jest działanie w dobrze zorganizowanym środowisku pracy.

To już wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.