Zoptymalizowana strategia transfekcji dla ekspresji i rejestracji elektrofizjologicznej rekombinowanych napięciowo zależnych kanałów jonowych w komórkach HEK-293T

Elektrofizjologia jest powszechnie stosowana do badania aktywności rekombinowanych napięciowo bramkowanych kanałów jonowych w hodowlach komórek embrionalnej nerki człowieka. Pomyślny pomiar wymaga, aby komórki wykazywały ekspresję kanałów na błonie komórkowej na poziomie wystarczającym do detekcji oraz aby zostały wysiane z odpowiednio niską gęstością, umożliwiającą izolację pojedynczych komórek. Przeprowadzanie pomiarów komórkowych jest często utrudnione przez długie okresy inkubacji w temperaturze 28 °C niezbędne do takiej ekspresji, co zazwyczaj prowadzi do utraty adhezji komórek i stabilności błony.

W niniejszym materiale zaprezentowano zoptymalizowaną metodę hodowli i transfekcji komórek, która pozwala uniknąć tych problemów. Komórki są transfekowane przy umiarkowanej wydajności, a następnie inkubowane w temperaturze 28 °C do momentu uzyskania odpowiedniej ekspresji kanałów jonowych. Następnie transfektowane komórki wysiewa się na szklane lamelle z niską gęstością i inkubuje w temperaturze 37 °C przez kilka godzin, aby umożliwić adhezję komórek i stabilizację błony.

Po odpowiednim wysiewaniu komórki są identyfikowane na podstawie koekspresji EGFP oraz za pomocą techniki patch clamp w konfiguracji whole-cell. Można przystąpić do rejestracji lub ponownie inkubować komórki w temperaturze 28 °C. Aby dodatkowo zwiększyć ekspresję kanałów na powierzchni, wyniki eksperymentów z rejestracją przeprowadzonych na komórkach transfekowanych napięciowo zależnymi kanałami wapniowymi, takimi jak L CAV one, L CAV two lub L cav three, wskazują na pomyślną transfekcję i ekspresję kanałów przez komórki.

Mimo że przedstawiono jedynie reprezentatywne wyniki dla L CAV three, w naszym laboratorium opracowaliśmy metodę zwiększającą ekspresję słabo eksponowanych genów kanałów jonowych w celu rejestracji metodą patch clamp w ludzkich liniach komórkowych. Obecnie konwencjonalne podejście polega na tym, aby najpierw wysiać komórki na szkiełkach podstawkowych i przeprowadzić transfekcję plazmidowym cDNA zawierającym geny kanałów jonowych, a następnie inkubować je przez wiele dni w temperaturze 28 °C, aby uzyskać wysoką wydajność ekspresji kanałów jonowych przed rejestracją elektrofizjologiczną. Nasze nowe podejście znacznie skraca wymagany czas inkubacji w temperaturze 28 °C przed rozpoczęciem pomiarów.

Skrócenie czasu inkubacji w 28°C powoduje, że membrany komórkowe są znacznie bardziej stabilne, a komórki po transfekcji znacznie lepiej przylegają do szkiełek podstawowych. Zwiększa to liczbę komórek nadających się do rejestracji i znacząco podnosi efektywność eksperymentów. Przed transfekcją należy pasażować w stosunku od 1:4 w pełni konfluenczną kolbę komórek HEK 2 9 3 T do nowej kolby o powierzchni 25 cm² i umieścić komórki w inkubatorze w temperaturze 37°C i przy 5% CO2.

Pozostawić komórki do przytwierdzenia na trzy do czterech godzin; po czterech godzinach zbadać komórki za pomocą kontrastu interferencyjnego (DIC), aby zweryfikować ich przytwierdzenie. Należy zauważyć, że komórki nie są już okrągłe i ulegają spłaszczeniu. Widoczne są wypustki lub pseudopodia.

Komórki o mniejszym stopniu konfluencji wyglądałyby tak samo, ale byłyby rozmieszczone w większych odstępach. Po przytwierdzeniu się komórek połączyć niezbędne odczynniki, aby przeprowadzić standardową transfekcję fosforanem wapnia. Przygotować łącznie 12 µg DNA w 600 µL roztworu do transfekcji na jedną kolbę.

W tym przypadku cDNA z różnych kanałów jonowych są klonowane do plazmidu P-I-R-E-S two EGFP. Transfekcja tego wektora ekspresyjnego do linii komórkowej ssaków skutkuje produkcją wzmocnionego zielonego białka fluorescencyjnego z tego samego mRNA co sklonowany insert, poprzez translację zainicjowaną w wewnętrznym miejscu wejścia rybosomu (IRES), znajdującym się bezpośrednio za sekwencją kodującą kanał jonowy, a przed sekwencją kodującą EGFP. Pozwala to na identyfikację komórek pozytywnie transfektowanych bez ryzyka zakłócenia funkcji białka, które mogłoby wystąpić w wyniku bezpośredniego połączenia białka EGFP z białkiem docelowym.

Nanieś roztwór do transfekcji na komórki kroplami za pomocą pipety, następnie delikatnie zakręć kolbą i pozostaw ją w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez noc. Następnego dnia sprawdź wydajność transfekcji, obserwując komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym. Prawidłowo transfekowane komórki powinny być zielone w całej swojej objętości.

Po potwierdzeniu przeprowadzenia transfekcji, ostrożnie pipetuj od czterech do pięciu mililitrów ciepłej pożywki do odwróconej kolby. Przemyj komórki, powoli odwracając kolbę tak, aby powierzchnia z komórkami znalazła się na dole, i kołysząc kolbą, aby roztwór płuczący delikatnie przepływał nad nimi. Usuń pożywkę i powtórz to płukanie.

Powtórz ten krok jeszcze dwa razy. Następnie dodaj do kolby sześć mililitrów pożywki i inkubuj w temperaturze 37 °C przez dwie godziny. Ekspresja bezkręgowcowych kanałów jonowych wiąże się z pewnymi trudnościami.

Po pierwsze, często mają one duże rozmiary, przez co ich translacja w siateczce śladowatej może trwać długo. Ponadto mogą nie być efektywnie kierowane do błony komórkowej w linii komórkowej ssaków. Wreszcie, ponieważ różne gatunki wykazują różną częstotliwość użycia kodonów, heterologiczne cDNA mogą zawierać wysoką częstotliwość kodonów rzadko występujących w komórkach ssaków, takich jak HEK 2 9 3 T, co utrudnia pokonanie niektórych z tych problemów.

Po dwugodzinnej inkubacji w temperaturze 37 °C po przemyciu transfektu, przenieść kolby do inkubatora w temperaturze 28 °C na okres od dwóch do sześciu dni, aby wydłużyć okres ekspresji. Czas inkubacji należy ustalić empirycznie dla każdego rodzaju eksponowanego kanału jonowego, ponieważ inkubacja w temperaturze 28 °C przez dłuższy czas prowadzi do odrywania się komórek i słabej stabilności błony.

Przed przeprowadzeniem badań elektrofizjologicznych konieczne jest dalsze przygotowanie komórek. Najpierw usunąć medium z przetransfekowanych komórek za pomocą pipety aspiracyjnej, a następnie wprowadzić 1 mL roztworu trypsyny o temperaturze 37 °C do odwróconej kolby. Następnie delikatnie przywrócić kolbę do pozycji z dnem skierowanym w stronę powierzchni komórek, aby trypsyna mogła łagodnie obmyć komórki.

Odwróć kolbę i usuń trypsynę. Następnie dodaj 250 µL ciepłej trypsyny bezpośrednio na komórki i inkubuj w temperaturze 37 °C przez trzy do pięciu minut, aż komórki się odkleją. W międzyczasie umieść od trzech do ośmiu szkiełek cover slips pokrytych poli-L-lizyną w naczyniu hodowlanym o średnicy 60 mm i dodaj 5 mL ciepłej pożywki hodowlanej.

Po ododerwaniu komórek, zawiesić je w czterech mililitrach ciepłej pożywki, pipetując roztwór w górę i w dół około sześciu razy. Następnie, za pomocą końcówki mikropipety, docisnąć szkiełka podstawowe, aby upewnić się, że znajdują się one na dnie naczynia. Następnie dodać od 250 do 500 µL zawiesiny komórek. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez trzy godziny, aby umożliwić ich przyleganie do szkiełek podstawowych.

Pozostawienie komórek w temperaturze 37°C przez zbyt długi czas doprowadzi do ich podziału i rozcieńczenia transfekowanych plazmidów. Transfekowane komórki należy wysiać przy dostatecznie niskiej gęstości, aby były od siebie odizolowane, jak pokazano tutaj. Ułatwi to rejestrację elektrofizjologiczną.

W przypadku komórek wymagających podjednostek pomocniczych często konieczne jest przeniesienie ich do temperatury 28 °C i inkubacja przez dodatkowe trzy do czterech dni przed badaniem elektrofizjologicznym. Rejestracja jest prowadzona w przypadku komórek, które nie wymagają podjednostek pomocniczych. Rejestrację można przeprowadzić bezpośrednio po zakończeniu tej inkubacji.

Zestaw do elektrofizjologii użyty w tym badaniu obejmuje wzmacniacz, zmotoryzowane, podwójne manipulatory do pipet, mikroskop fluorescencyjny z oświetleniem epifluorescencyjnym oraz systemy perfuzji. Sprzęt został zamontowany na stole wibroizolacyjnym. Zakłócenia elektryczne są ograniczane przez klatkę Faradaya typu dwa o wysokości 40 cali. Systemy sterowania elektronicznego obejmują komputer PC wyposażony w moduł DigiData 1440, który jest interfejsem przetwornika analogowo-cyfrowego, współpracujący z oprogramowaniem pCLAMP 10.1.

Wzmacniacz monitora komputerowego, zmotoryzowany manipulator oraz system sterowania przepływem łącznika zaworowego są zamontowane na zewnątrz klatki Faradaya. Cała aparatura elektryczna jest zamontowana na wolnostojącej, 19-calowej metalowej szafie rack, uziemiona do miedzianego rozdzielacza i podłączona do transformatora izolacyjnego klasy medycznej, który zapewnia izolację linii, stabilne uziemienie oraz tłumienie przepięć. Przed rozpoczęciem eksperymentów należy zamontować wypalane mikropipety o oporności od 2 do 5 MΩ w uchwycie mikropipet na głowicy.

Pipety patch wypełnia się roztworem wewnętrznym, a następnie wykonuje się szybkie uderzenie w ściankę pipety (flick), aby usunąć pęcherzyki powietrza, po czym montuje się je na głowicy wzmacniacza. Następnie, za pomocą pęsety, przenosi się jedno szkiełko podstawowe z wysianymi komórkami do 35 milimetrowej plastikowej szalki Petriego zawierającej trzy mililitry zewnętrznego roztworu rejestracyjnego w temperaturze pokojowej. Objętość roztworu rejestracyjnego musi być odmierzona precyzyjnie podczas przeprowadzania eksperymentów z lekami, w których znane ilości leku są dodawane do szalki za pomocą mikropipety; następnie szalkę umieszcza się na stole mikroskopu.

Następnie wypełnij półkomórkę uchwytu mikroelektrody roztworem chlorku cezu o stężeniu 3 M. Wprowadź elektrodę odniesienia do półkomórki, a następnie za pomocą mikromanipulatora umieść elektrodę uziemiającą w kąpieli i opuść pipetę do patch-clamping do roztworu kąpielowego. Wizualizuj komórki w trybie fluorescencyjnym i wycentruj pojedynczą, pozytywnie przetransfekowaną, przylegającą zieloną komórkę na środku pola widzenia.

Podczas pracy w trybie kąpielowym, zbliż pipetę do komórki. Wyzeruj przebieg fali prostokątnej widoczny na ekranie komputera. Dostosuj położenie pipety tak, aby delikatnie dotykała komórki, a przebieg prądu prostokątnego na ekranie zaczął wykazywać fluktuacje.

Stosuj delikatne ssanie za pomocą podłączonej strzykawki, aż do uzyskania uszczelnienia typu gigaohm (giga ohm seal). Po uzyskaniu uszczelnienia gigaohm przełącz program w tryb patch. Wykonaj szybki impuls ssania strzykawką, aby przebić błonę komórkową.

Następnie przełącz urządzenie w tryb komórkowy (cell mode) i zastosuj parametry dla całej komórki na wzmacniaczu. Aby skompensować przejściowy prąd pojemnościowy, konieczne jest zrównoważenie patcha, tak aby wewnątrzkomórkowy roztwór rejestrujący przedostał się do zapatchowanej komórki poprzez dializę. Tutaj wprowadź protokoły clampowania napięcia opracowane dla tego eksperymentu.

Eksperymentator opracował protokół do pomiaru prądów jonowych przepływających przez napięciowo zależne kanały jonowe, które powstają w wyniku modulacji napięcia przez błonę komórkową. W tym przypadku analizujemy protokół IV, który określa, że oprogramowanie utrzymuje komórkę przy potencjale trzymającym wynoszącym -110 mV, a następnie wykonuje skok do -70 mV przez 250 ms. Następnie potencjał wraca do poziomu trzymającego -110 mV, przy czym każdy kolejny skok zwiększa się o 10 mV, tak aby kolejne stopnie wynosiły -70 mV, -60 mV i tak dalej, aż do ostatniego skoku do +20 mV.

Przefiltruj zarejestrowane prądy przy 10 kilohertz, stosując filtr dolnoprzepustowy Bessela w wzmacniaczu, a następnie przeprowadź digitalizację z częstotliwością próbkowania 2 kilohertz, korzystając z oprogramowania clamp X 10.1; używaj wyłącznie zapisów z minimalnym wyciekiem poniżej 10%. Do analizy wykorzystano komórki HEK 2 93 T, które hodowano i transfekowano L Cav. Trzy kanały wapniowe, jak pokazano tutaj. Poprawną transfekcję cDNA heterologicznych kanałów jonowych potwierdzono poprzez fluorescencję generowaną przez wektor P-I-R-E-S two eeg FP.

W niniejszej pracy przedstawiamy udaną ekspresję bezkręgowca z kanału wapniowego typu Cav3. W przypadku komórek nietransfekowanych nie udaje się wywołać prądów wapniowych. Natomiast komórki transfekowane generują duże prądy podczas zastosowania protokołów zaciskania napięcia całej komórki.

Badacze mogą stosować różne warunki elektrofizjologiczne i schematy analizy danych w zależności od swoich wymagań. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby kierować się własnym doświadczeniem w kwestii czasu trwania eksperymentów. Ponieważ różne kanały są eksponowane w błonie komórkowej z różną wydajnością, to od badacza zależy określenie optymalnej strategii, która zwiększy żywotność komórek oraz zmaksymalizuje ekspresję powierzchniową interesujących go kanałów.

Mamy nadzieję, że po obejrzeniu tego filmu zdobyli Państwo gruntowną wiedzę na temat tego, jak hodować i utrzymywać ludzką linię komórkową, a także jak transfekować te komórki heterologicznymi cDNA kanałów jonowych oraz cDNA podjednostek w celu przeprowadzenia pomiarów elektrofizjologicznych.