Indukowane środowiskowo dziedziczne zmiany u lnu

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zaprezentowanie metody hodowli indukcyjnej odmiany lnu w warunkach prowadzących do powstania dziedzicznych wariacji genomowych. Ponadto monitorowane są zmiany genomowe, a wzrost roślin indukowanych w kolejnych pokoleniach jest obserwowany w różnych środowiskach. Aby to osiągnąć, len jest hodowany w zróżnicowanych warunkach indukcyjnych.

Następnie pobiera się próbki tkanek liści i łodyg Maris w różnych punktach czasowych podczas wzrostu roślin w zróżnicowanych warunkach środowiskowych. W kolejnym kroku z próbek tkanek izoluje się DNA i RNA. Ostatnim etapem procedury jest przeprowadzenie reakcji PCR z wykorzystaniem próbek DNA oraz Q-R-T-P-C-R z wykorzystaniem wyizolowanego RNA w celu zidentyfikowania zmian genomicznych oraz zmian w ekspresji genów wynikających z uprawy w różnych warunkach środowiskowych.

Ostatecznie można uzyskać wyniki wykazujące odpowiedź genomiczną na warunki wzrostu w postaci pojawienia się elementu insercyjnego LIS1 w konkretnym miejscu w genomie oraz różnice w ekspresji związane z obecnością tego elementu, co można zwizualizować za pomocą PCR i R-T-P-C-R przeprowadzonych z wykorzystaniem kwasów nukleinowych wyizolowanych z tkanek roślin poddanych działaniu preparatu. Cześć, jestem Chris Cull z Katedry Biologii na Case Western Reserve University. Jestem Cory Johnson z laboratorium prof. Culla.

Jestem Tiffany Moss, również z laboratorium Cull. A ja jestem Marshall Lucas, student studiów licencjackich w ramach letniego programu badań dla studentów w laboratorium Cull.

W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę do badania zmian w genomie i ekspresji genów wynikających ze zmienności środowiska wzrostu. Zacznijmy zatem. Aby wyhodować len w warunkach indukujących, należy najpierw wypełnić pięciocalowe doniczki ziemią i ją ubić.

Następnie posadź trzy nasiona lnu w każdej doniczce na głębokości jednej czwartej cala. Następnie przykryj nasiona ziemią w przypadku warunków kontrolnych nieindukujących. Podlej rośliny 100 mililitrami roztworu Miracle-Gro o stężeniu 1/10.

Rośliny w warunkach wysokiej podaży składników odżywczych potraktuj 100 mililitrami pełnej mocy roztworu Miracle grow. Na koniec zastosuj.

Rośliny o niskiej zawartości składników odżywczych podlewaj wyłącznie wodą z kranu. W okresie letnim rośliny hoduj przy świetle naturalnym w miarę ich wzrostu. Podlewaj wszystkie rośliny za pomocą automatycznego systemu zraszania dwa razy dziennie przez pięć minut.

Warunki wzrostu należy stosować w odniesieniu do roślin raz w tygodniu. Liście oraz łodygi zbierać w odstępach tygodniowych. Do ekstrakcji DNA pobiera się sześć liści, a do ekstrakcji RNA potrzebne są trzy łodygi. Po zebraniu materiał roślinny należy umieścić w probówce kriogenicznej, szybko zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać próbki w temperaturze -80 °C do momentu ekstrakcji.

Trzy genotypy rosną w różnym tempie względnym w zależności od warunków. W warunkach kontrolnych najlepiej rośnie inbredyjna odmiana lnu Storm lub linia PL. Z tego rodzica wyewoluowało kilka linii, przy czym odmiana duża (L) wykazuje większą żywotność niż odmiana mała (S).

Jednakże w warunkach niskiej dostępności składników odżywczych linia S rośnie lepiej niż L lub pl. Natomiast w warunkach wysokiej dostępności składników odżywczych linia L rośnie lepiej niż pl, która rośnie jedynie nieco lepiej niż S. Porównanie poszczególnych linii hodowanych w trzech różnych wariantach traktowania wykazuje, że pl rośnie najlepiej w warunkach kontrolnych. Linia L rośnie najlepiej w warunkach wysokiej dostępności składników odżywczych, a linia S rośnie podobnie zarówno w warunkach wysokiej dostępności składników odżywczych, jak i w warunkach kontrolnych.

Dane te pokazują, że trzy linie można rozróżnić na podstawie ich wzrostu w trzech środowiskach. Podczas gdy PL i L rosną lepiej w określonych środowiskach, S rośnie w podobnym stopniu we wszystkich trzech warunkach. Linia S nie jest w stanie wykorzystać poprawionych warunków odżywczych, ale lepiej radzi sobie ze wzrostem w warunkach bardzo niskiej zawartości składników odżywczych.

W celu ekstrakcji DNA do sześciu liści znajdujących się w probówce do wirówki z dodatkiem sterylnego piasku należy dodać bufor AP1 z zestawu Qiagen DNEZ Plant DNA Prep Kit, a następnie rozetrzeć tkankę mikrościerką, aż do całkowitego rozbicia grudek. Ekstrakcję należy kontynuować zgodnie z instrukcją dołączoną do zestawu. Aby rozpocząć ekstrakcję RNA, należy przenieść trzy łodygi maris wraz z częścią okolicznych liści z krio probówki do probówki do wirówki. Do probówki należy dodać sterylny piasek i rozetrzeć tkankę za pomocą mikrościerki, aż zostanie ona drobno zmielona.

Próbkę mieszaj w wstrząsarze typu vortex przez 15 sekund, aby wspomóc lizę, a następnie wiruj przez jedną minutę przy 13 000 RPM w celu osadzenia piasku i wszelkich zanieczyszczeń. Przenieś nadnadkład SNAT do kolumny wiążącej i kontynuuj przygotowanie RNA zgodnie z instrukcjami producenta. Po wyekstrahowaniu RNA z tkanki, dodaj do reakcji bufor 10 XDNA w objętości stanowiącej 1/10 objętości próbki RNA.

Dodając 30 jednostek DNaz, inkubować reakcję w temperaturze 37°C przez 30 minut, a następnie w 70°C przez pięć minut. Przeprowadzić odwrotną transkrypcję przy użyciu zestawu Applied Biosystems RNA to cDNA. Zgodnie z instrukcjami producenta, inkubować reakcję w temperaturze 37°C przez jedną godzinę, a następnie w 95°C przez pięć minut.

Na koniec naniesie 5 µL cDNA na żel agarozowy 1,5%, aby określić wydajność. Po przygotowaniu cDNA z lnu zostaje ono wykorzystane do qPCR. Przeprowadź qPCR, korzystając z systemu ABI StepOne.

Wszystkie testy należy przeprowadzić w trzech powtórzeniach dla każdego przebiegu, a w celu przygotowania reakcji do QPCR należy wykorzystać gen housekeeping Acton jako kontrolę liczby kopii. Do każdej probówki należy dodać jeden mikrolitr odpowiedniej pary starterów. DNA CD należy rozcieńczyć do odpowiedniego stężenia i dodać dziewięć mikrolitrów do każdej probówki.

Na koniec do każdej probówki dodaj 10 µL 2x cyberg green PCR master mix. Następnie ustaw program amplifikacji zgodnie z procedurą amplifikacji. Oblicz względne poziomy ekspresji na podstawie liczby cykli dla progu (threshold), wyznaczonej przez domyślne parametry w oprogramowaniu step one i potwierdzonej poprzez analizę krzywych amplifikacji.

Amplifikacja PCR DNA wyizolowanego z liści w różnych pozycjach wzdłuż łodygi wykazuje pojawienie się pojedynczej kopii fragmentu DNA o długości 5,7 kilobazy, zwanego sekwencją insercji linii lub LIS one, gdy rośliny są hodowane w warunkach indukujących. LIS one pojawia się, gdy PL jest hodowany w indukujących warunkach niedoboru składników odżywczych i ostatecznie staje się homozygotyczny. W tym przypadku próbki liści od jeden do sześć pobierano w odstępach tygodniowych, przy czym próbka jeden była pobrana najwcześniej po wysiewie; następnie z próbek wyekstrahowano DNA.

Amplifikacja PCR ujawnia obecność obu końców LAS one we wszystkich próbkach z wyjątkiem pierwszej. Odpowiada to zanikowi miejsca insercji unins i brakowi dowodów na jego obecność w piątym liściu podczas qPCR. Wyniki wskazują, że obecność LAS one lub inne zmiany genomiczne związane z indukcją wpływają na ekspresję genów w bezpośrednim sąsiedztwie a S one.

Sześć przedstawionych tutaj genów wykazuje zróżnicowaną ekspresję w PL i S; cztery z tych genów mają wyższą ekspresję w pl, które nie posiada LIS one. Odwrotnie, dwa mają wyższą ekspresję w S, które posiada LIS one. Właśnie pokazaliśmy Państwu, jak hodować indukowalne linie lnu. Zatem genom zmienia się w odpowiedzi na środowisko wzrostu oraz cechy wzrostowe kolejnych pokoleń.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że warunki hodowli muszą zostać powtórzone, aby zapewnić odtwarzalność indukowanych zmian. To wszystko. Wiem, że wielu z Państwa podchodzi sceptycznie do tego zjawiska, ale teraz możecie Państwo samodzielnie zreprodukować te obserwacje.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.