Analiza pluripotencjalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem krioprzesieków ciałek zarodkowych

Część pierwsza, Wprowadzenie. Cześć, nazywam się Rafael. Jestem pracownikiem postdoktorem w laboratorium profesora Stevensa Hansa na Federalnym Uniwersytecie w Rio de Janeiro w Brazylii.

Cześć, nazywam się Ismail. Jestem asystentem naukowym oraz profesorem. W tym filmie pokażemy, jak przygotować przejrzyste przekroje ciał Android.

Zacznijmy zatem. Część druga: materiały i sprzęt. Do przeprowadzenia tej procedury będziemy potrzebować medium do zatapiania próbek mrożonych.

4% roztwór paraformaldehydu do fiksacji komórek, roztwory sacharozy do krioprotekcji. Igła z lekko zagiętym końcem, stereomikroskop do lepszej wizualizacji EBS oraz wytrząsarka. Część trzecia.

Tutaj ciała zaplastrykowane ludzkiego zarodka są hodowane na płytkach do hodowli nieadherentnych. Za pomocą pipety grupujemy wszystkie ciała zaplastrykowane jak najbliżej siebie, aby przenieść je do stożkowatej probówki o pojemności 15 ml. EBS są ostrożnie zbierane i przenoszone do probówki.

Ważne jest zebranie wszystkich ciał inkluzyjnych (ebs), ponieważ ilość materiału jest niewielka. Po zdekantowaniu EBS ostrożnie usuwa się pożywkę hodowlaną. Na dnie probówki powinien być widoczny osad. Teraz można przejść do procedury fiksacji.

EBS zostaną utrwalone w 4% roztworze paraformaldehydu w PBS lub soli fosforanowo-buforowanej. Ważne jest, aby zawiesinę ponownie rozpuścić w roztworze PFA. Następnie EBS utrwala się w roztworze utrwalającym przez 30 minut.

Po utrwaleniu ostrożnie usuwa się roztwór PFA. Dbając o to, aby nie zawiesić ponownie EBS, zastępuje się go 10% roztworem sacharozy w PBS w celu rozpoczęcia krioprotekcji EBS; materiał pozostawia się w tym roztworze na 30 minut. Następnie ostrożnie usuwamy 10% roztwór sacharozy i resuspendujemy EBS w 20% roztworze sacharozy.

Następnie EBS są ponownie inkubowane w tym roztworze przez 30 minut. Na koniec 20% roztwór sacharozy zostaje usunięty i zastąpiony 30% roztworem sacharozy w PBS, w którym próbki pozostają przez kolejne 30 minut. Teraz można przejść do orientacji i blokowania EBS.

W naszym laboratorium jako formy wykorzystujemy puste kapsułki. W celu blokowania ebs istotne jest pokrycie wewnętrznych ścianek końcówki roztworem sacharozy przed zebraniem ebs. Teraz można ostrożnie zebrać EBS i poczekać, aż opadną one na dno końcówki.

Następnie EBS są umieszczane w centrum bloku. Powinna to być ich ostateczna pozycja wewnątrz bloku. Za pomocą stereomikroskopu i cienkiej końcówki zbieramy i usuwamy jak największą ilość roztworu sacharozy.

Należy cały czas uważać, aby nie zebrać ciał zapasowych (ebs). Za pomocą igły z lekko zagiętym czubkiem wszystkie EBS zostają umieszczone na środku bloku. Na koniec pozostały roztwór sacharozy zbiera się za pomocą kawałków papieru filtracyjnego.

Dokładna lokalizacja EBS wewnątrz bloku jest bardzo istotna dla uzyskania wysokiej jakości skrawków. Oto przykład niewłaściwego rozmieszczenia EB wewnątrz powłoki. Po umieszczeniu EBS i usunięciu roztworu sacharozy, powłoka jest wypełniana OCT, zaczynając od krawędzi, przy jednoczesnym zachowaniu szczególnej ostrożności, aby nie dopuścić do zawieszenia ebs w roztworze.

Pozostałe pęcherzyki powietrza usuwa się pipetą, a następnie muszle miesza się przez 15 minut. Po wymieszaniu blok OCT mrozi się w suchem lodzie.

Na tym etapie można przechowywać blok zawinięty w folię aluminiową w temperaturze -80 °C do dalszych analiz lub przejść do części czwartej protokołu kriostatu: Cięcie. Do przygotowania przekrojów mrożonych będą potrzebne ostrze jednorazowe lub stałe, OCT oraz szkiełka przedmiotowe wstępnie potraktowane poli-L-lizyną. Blok OCT zostaje wyjęty z zamrażarki i umieszczony w kriostacie, aż osiągnie temperaturę -20 °C.

Następnie blok zostaje umieszczony na uchwycie i wyrównany równolegle do krawędzi noża. Próbki EB są znacznie mniejsze niż większość innych próbek tkanek, dlatego bardzo ważne jest upewnienie się, że cała powierzchnia bloku styka się z nożem w tym samym czasie, co minimalizuje stratę materiału. Po ustawieniu blok zostaje pocięty na plastry o grubości 10 micrometer, które są zbierane bezpośrednio na szkiełka przedmiotowe.

Preparaty mogą być przechowywane, najlepiej w temperaturze -70°C, lub wykorzystane tego samego dnia. Materiał może zostać poddany barwieniu immunohistochemicznemu lub immunofluorescencyjnemu. Podsumowanie. Opisana tutaj metoda stanowi stosunkowo niedrogą i łatwą do przeprowadzenia procedurę uzyskiwania cienkich skrawków kriostatycznych ciał embrionalnych rozwiniętych z linii komórek macierzystych ludzkich H9 lub mysich US P1.

Otrzymane skrawki mrożone mogą być wykorzystywane w szerokim zakresie procedur w celu analizy ekspresji białek lub morfologii ciał embroidalnych (EB).