Kriokonserwacja bloków tkanki kory mózgowej w celu generowania silnie wzbogaconych kultur neuronalnych

Witajcie, nazywam się Alan i pracuję w laboratorium dr Horney Lu na University of California Irvine w Departamencie Neurobiologii i Behawiorystyki. A ja jestem Bob. Dzisiaj dr Haro zaprezentuje szybki, wydajny i niezawodny protokół rutynowej krio konserwacji bloków tkanki kory mózgowej w celu późniejszej regeneracji wysokiej jakości pierwotnych kultur neuronowych.

Zacznijmy zatem. Oczyszczoną i posiekaną tkankę umieszcza się w probówkach kriogenicznych zawierających 10% TMSO medium do mrożenia.

Probówki kriogeniczne są umieszczane w pojemniku do zamrażania i przechowywane w temperaturze -80°C przez co najmniej cztery godziny. Zamrożone probówki kriogeniczne są następnie przenoszone do ciekłego azotu w celu długoterminowego przechowywania. W celu hodowli probówka kriogeniczna z AC jest rozmrażana w ciepłej kąpieli wodnej, a następnie płukana ciepłym HBSS w celu usunięcia pozostałego DMSO.

Dodaje się świeże HBSS wraz z trypsyną w celu dysocjacji, po czym dodaje się DMM z 10% EBS. Aby zatrzymać enzymatyczną aktywność dysocjacyjną, komórki są wirowane, a osad resuspendTime w świeżym DMM z dodatkiem 10% EBS i wysiewany na naczynia powlekane polilizyną. Po 24 godzinach DMM zostaje zastąpiony suplementowanym medium neurobasal i komórki są hodowane przez 10 dni.

W niniejszym protokole do siekania tkanki korowej przed użyciem wykorzystuje się stalowe ostrze żyletki. Ostrze musi być sterylizowane w 70% ethanolu przez co najmniej dwie godziny. Roztwór soli buforowej Hanksa HBSS o stężeniu 1x przygotowuje się poprzez rozcieńczenie 10-krotnego roztworu zapasowego w sterylnej wodzie; tak przygotowany roztwór 1x HBSS przechowuje się następnie na lodzie lub w temperaturze czterech stopni Celsjusza do momentu obróbki tkanki.

Dimetylosulfotlenek lub DMSO jest stosowany jako krioprotektant w medium do mrożenia. Niniejszy protokół wykorzystuje rozcieńczenie DMSO w objętości 10% v/v w 1X-H-B-S-S-D-M-S-O; roztwór należy całkowicie wymieszać przed przechowywaniem w temperaturze 4 °C. Do kontrolowania szybkości zamrażania próbek wykorzystuje się pojemnik do mrożenia Nalgene.

Pojemnik do mrożenia wypełnia się wcześniej oznakowanymi probówkami kriogenicznymi o pojemności 2,5 mililitra. W przypadku korzystania z kilku pojemników do mrożenia zaleca się ich odpowiednie oznakowanie i zaznaczenie przypisanego pojemnika na probówce. Wcześniej schłodzone medium do mrożenia z 10% DMSO oraz pojemnik do mrożenia zostają przeniesione do sterylnej komory bezpieczeństwa biologicznego.

W tym miejscu do każdej z fiolek kriowych powoli dodaje się jeden mililitr medium do mrożenia. Po upewnieniu się, że zakrętki są szczelnie zamknięte, należy umieścić pojemnik do mrożenia z fiolkami w temperaturze czterech stopni Celsius za co najmniej dwie godziny przed obróbką tkanki. Wcześniej wysterylizowane ostrze żyletki należy dokładnie wypłukać, wykonując trzy trzyminuotowe płukania.

Użycie sterylnej wody powinno być wystarczające do usunięcia pozostałości etanolu. Procedura płukania powinna być szybka, ponieważ żyletka jest podatna na utlenianie podczas przedłużonego zanurzenia w sterylnej wodzie. Przed oczyszczaniem tkankę należy umieścić w okładzie z lodu.

Przepłucz lekko zimnym roztworem X-H-B-S-S, aby usunąć wszelkie swobodnie pływające zanieczyszczenia. Do oczyszczenia fragmentów tkanki z pozostałości błon i naczyń krwionośnych należy użyć wysterylizowanych igieł. Podczas oczyszczania należy zachować szczególną ostrożność, aby nie naruszyć strukturalnej integralności tkanki.

Wraz ze wzrostem tej wartości, efektywność siekania oczyszczonej tkanki będzie wyraźnie inna niż w przypadku tkanki surowej; większość błon lub naczyń krwionośnych powinna zostać usunięta. Po oczyszczeniu i wypłukaniu tkanki można przystąpić do siekania. Ważne jest, aby wykonywać precyzyjne cięcia tkanki, tworząc bloki o wielkości około jednego milimetra sześciennego.

Bloki o zbyt dużym rozmiarze powodują niższy odzysk komórek podczas rozmrażania. W przypadku mniejszych bloków należy jednak unikać nadmiernego przetwarzania. Posiekane tkanki można zbierać za pomocą autopipety i niewielkiej ilości schłodzonego X-H-B-S-S.

Należy wypłukać naczynie za pomocą HBSS, aby odzyskać całą zebraną tkankę. Następnie tkankę dodaje się do dużej objętości 1X HBSS i pozwala jej opaść na dno, tworząc luźny osad. Pozwala to usunąć wszelkie pozostałe zanieczyszczenia; w czasie, gdy tkanka osiada w HBSS, należy przygotować wcześniej schłodzony pojemnik do mrożenia oraz probówki kriogeniczne przed rozdziałem tkanki.

Należy odkręcić wszystkie fiolki, aby przyspieszyć proces napełniania tkanką. Ekspozycja na DMSO w temperaturze pokojowej nie powinna przekraczać 10 minut. Zaleca się pracę z jednym pojemnikiem do mrożenia na raz, aż do wykorzystania całej tkanki.

Zacznij od aspiracji supernatu z luźnej tkanki, zbliżając końcówkę tak blisko osadu, jak to możliwe, aby go nie naruszyć. Następnie załóż na pipetę końcówkę o szerokim otworze o pojemności 200 µL. Nie należy używać końcówek o mniejszym otworze, ponieważ mogłoby to naruszyć strukturę bloków osiadających na dnie pelletu tkankowego.

Należy powoli pobrać 200 µL tkanki. Umieścić tkankę w probówce kriogenicznej i powtarzać czynność dla kolejnych próbek, aż wszystkie probówki zostaną wypełnione. Może być wymagane zastosowanie zasady 10 minut.

Szybko przenieś pojemnik z probówkami kriogenicznymi do zamrażarki w temperaturze -80°C na co najmniej cztery godziny lub na noc, jeśli czas jest ograniczony. Po upływie odpowiedniego czasu wyjmij pojemnik z zamrażarki i jak najszybciej umieść probówki kriogeniczne w pudełku kriogenicznym. Umieść pudełko kriogeniczne w statywie z pojemnikiem na ciekły azot w celu długoterminowego przechowywania.

Wyjmij probówkę kriogeniczną z ciekłego azotu tak szybko, jak to możliwe, ograniczając czas ekspozycji pudełek kriogenicznych na temperaturę pokojową. Szybko rozmroź próbkę, zanurzając ją w łaźni wodnej o temperaturze 37°C. Zawsze utrzymuj zakrętkę powyżej poziomu wody. Często sprawdzaj stan próbki i kontynuuj rozmrażanie, aż do momentu zaobserwowania małego kryształka lodu.

Przed wprowadzeniem do komory bezpiecznej sterylizuj probówkę kriogeniczną 70% ethanolem. Jeśli tkanka pozostanie na ściankach probówki kriogenicznej, dodaj do rozmrożonej tkanki dużą objętość ciepłego roztworu one X-H-B-S-S. Ostrożnie zbierz materiał za pomocą HBSS.

Po zebraniu całej tkanki należy odwrócić probówkę trzy do czterech razy i pozwolić tkance opaść na dno. Krok ten zapewnia odpowiednie rozcieńczenie DMSO.

Po osadzeniu tkanki odessać jak największą ilość supernatantu. Następnie dodać do niej 10 milliliters ciepłego, świeżego 1X HBSS. Dodać 300 microliters 0,25% trypsyny oraz 50 microliters DNase.

Następnie należy rozdzielić tkankę poprzez delikatne wytrząsanie, aż do uzyskania zmętnionej zawiesiny komórkowej. Aktywność enzymatyczną należy zatrzymać, dodając ciepłe DMEM z dodatkiem 10% wzbogaconego surowicy bydlęcej (EBS). Zawiesiny komórkowe należy wirować przy 1200 G przez pięć minut. Osad komórkowy należy zawiesić ponownie w świeżym DMEM z dodatkiem 10% EBS i wysiać na płytki pokryte polilizyną.

Pozostaw komórki do przyczepienia do naczyń na 30 minut. Następnie wymień pożywkę na świeże DM z dodatkiem 10% EBS. Po 24 godzinach wymień pożywkę DM na pożywkę neurobasal uzupełnioną o N2 i B27 i hoduj przez 10 dni.

Przedstawiliśmy właśnie obszerny, wydajny i niezawodny protokół rutynowej kriokonserwacji bloków tkanki korowej. Życzymy powodzenia.