Zacisk hiperinsulinemiczno-euglikemiczny u świadłego szczura

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ocena wrażliwości na insulinę u świadłego, nieskrępowanego szczura. Jest to realizowane poprzez uprzednie wprowadzenie cewnika do lewej tętnicy szyjnej. Następnie kaniulowana jest prawa żyła szyjna, aby zapewnić optymalne wyniki.

Cewniki są codziennie przemywane w celu utrzymania ich drożności podczas pięciodniowego okresu rekonwalescencji pooperacyjnej. Ostatecznie, z hiperinsulinemiczno-euglikemicznego zacisku można uzyskać wyniki wykazujące wskaźniki infuzji glukozy do całego organizmu. Główną zaletą tej techniki jest możliwość uzyskania bezpośrednich pomiarów wskaźników utylizacji glukozy w całym organizmie przy wysokich fizjologicznych poziomach insuliny.

Kaniule tętnicze i żylne muszą zostać przygotowane przed rozpoczęciem procedury chirurgicznej. Kaniule powinny mieć zaokrąglone końce, być wypełnione solą fizjologiczną z heparyną i wysterylizowane etanolem, z mocno przymocowaną gumką zabezpieczającą w odległości odpowiednio 2,7 lub 3,2 centymetra od jednego końca dla kaniul tętniczych i żylnych. W tej procedurze wykorzystuje się dorosłe samce szczurów linii Sprague Dawley o masie około 300 gramów.

Zanotuj początkową masę ciała zwierzęcia i wykorzystaj tę wartość do monitorowania przyrostu masy po operacji. Pracuj w aseptycznym obszarze chirurgicznym. Zanieść szczura 3% isofluranem, umieszczając go w komorze anestezjologicznej.

Przenieś zwierzę poza obszar chirurgiczny i przygotuj miejsce nacięcia, usuwając sierść z okolic szyi i barków. Po usunięciu sierści umieść zwierzę w stożku nosowym, aby podtrzymać anestezję przy użyciu około 2% izofluranu. Przymocuj zwierzę do stołu operacyjnego.

Upewnij się, że szczur jest w pełni znieczulony, sprawdzając obecność odruchów stopy i/lub oka. Oczyść miejsce nacięcia 70% ethanol, następnie wykonaj scrub Betadine, a na koniec ponownie przemyj 70% ethanol. Pierwszym krokiem procedury jest wykonanie niewielkiego pionowego nacięcia w linii środkowej 10 millimeter powyżej mostka.

Używając zakrzywionej pęsety mikrosekcyjnej, wykonaj tępe rozdzielenie tkanek, aby odsłonić lewy mięsień mostkowo-乳様owy (sternomastoideus). Odchyl ten mięsień, aby odsłonić około jednego centymetra lewej tętnicy szyjnej. Umieść pęsetę mikrosekcyjną pod tętnicą szyjną, aby ją ustabilizować, delikatnie oddzielając tkankę łączną.

Ważne jest, aby wyizolować nerw błędny od tętnicy, nie uszkadzając ani tętnicy, ani nerwu. Należy użyć sterylnej nici jedwabnej 4-0 do podwiązania końca cephaladnego. Naczynie należy zacisnąć ząbkowaną mikropincetą anatomiczną.

Nakłuć miejsce podwiązywania. Zakończyć adapterem do wielokrotnego pobierania próbek o rozmiarze 21 G. Wyjąć stalowy korek z cewnika i za pomocą sterylnego wprowadzacza do cewników wprowadzić go do tętnicy.

Użyć pęsety, aby upewnić się, że kaniula jest stabilna. Częściowo zwolnić mikro-pęsetę dyssekcyjną, zaciskając tętnicę, i kontynuować wprowadzanie kaniuli aż do koralika. W tym momencie końcówka kaniuli powinna znajdować się w łuku aorty.

Zabezpiecz dwa szwy poniżej koralika i jeden powyżej, a następnie przemyj linię heparynowaną solą fizjologiczną w stężeniu 10 jednostek na mililitr. Aby potwierdzić drożność cewnika, ponownie zamknij jego zewnętrzny koniec za pomocą stalowego korka. Następnie wykonaj tępe rozczepianie tkanek, aby odsłonić prawą żyłę szyjną zewnętrzną, ostrożnie wyizoluj żyłę i podwiąż żyłę głowną.

Zakończyć szwem jedwabnym. Nakłuć żyłę igłą 21 G. Wypchnąć adapter do pobierania próbek multis.

Wyjąć stalowy korek z cewnika i za pomocą sterylnego wprowadzacza wprowadzić go aż do koralika. Zabezpieczyć dwa szwy poniżej koralika i jeden powyżej. Następnie przemyć linię fizjologicznym roztworem z heparyną o stężeniu 10 jednostek na mililitr.

Aby potwierdzić, że cewnik pobiera próbki, należy ponownie zamknąć zewnętrzny koniec cewnika za pomocą stalowego korka, wykorzystując do tego tępą igłę o rozmiarze 14 G, przeprowadzić go podskórnie i wykonać nacięcie na grzbiecie szczura pomiędzy łopatkami. Następnie należy przeciągnąć cewniki przez igłę tak, aby wystawały z grzbietu szczura. Widoczna powinna być około cztery centymetry każdego cewnika.

Odetnij 0,5 centymetra rurki medycznej Tigon S 50 HL i umieść ją wokół obu zewnętrznych cewników. Zabeziecz niebieską taśmą w przypadku żył i czerwoną w przypadku tętnic. Ponownie sprawdź drożność cewników, a następnie przepłucz i wypełnij je solą fizjologiczną z heparyną o stężeniu 150 jednostek na mililitr, aby zapobiec krzepliwości.

Zamknąć wszystkie nacięcia za pomocą nici jedwabnej 3-0. Umieścić szczura w pozycji brzusznej w wcześniej ogrzanej, czystej klatce z łatwo dostępnym pokarmem. Gdy szczur w pełni odzyska zdolność poruszania się i czujność, przenieść go z powrotem do klatki macierzystej.

Pozostawić szczura w celu rekonwalescencji przez trzy do pięciu dni, monitorując codziennie pod kątem infekcji, bólu oraz zmian masy ciała. Ważne jest, aby przez cały okres badania zachować drożność cewnika. Każdego dnia po operacji należy napełnić strzykawki z końcówką typu slip tip o objętości jednego mililitra solą fizjologiczną z heparyną w stężeniu 150 jednostek na mililitr i zamknąć je tępą igłą o rozmiarze 22G.

Tępa igła zostaje włożona do 20 centymetrów rurki PE 50 z łącznikiem z rurki ze stali nierdzewnej o rozmiarze 23 G na drugim końcu. Należy upewnić się, że z przewodu usunięto wszystkie pęcherzyki powietrza. Zaciśnij kleszczykami tętnicę zewnętrzną szczura, tuż poniżej zatyczki.

Usuń stalową zatyczkę cewnika, używając drugiej pary kleszczyków hemostatycznych. Wprowadź złączkę rurki połączoną ze strzykawką do linii tętniczej i zwolnij kleszczyki hemostatyczne blokujące zewnętrzny fragment cewnika tętniczego. Następnie odessać krew tętniczą z cewnika do strzykawki.

Jeśli cewnik nie zasysa płynu z łatwością, może być konieczne bardzo delikatne wciśnięcie niewielkiej ilości roztworu przez cewnik w celu odblokowania końcówki. Po tym zabiegu cewnik uznaje się za drożny. Gdy krew dotrze do zacisku strzykawki, należy zapiąć zacisk P 50 na prowadnicy w pobliżu strzykawki o objętości 1 ml, a następnie zutylizować strzykawkę.

Wymień strzykawkę na nową, wypełnioną świeżym lodowatym roztworem soli fizjologicznej z heparyną. Otwórz zacisk rurki i, trzymając nową strzykawkę pionowo, stuknij w nią, aby przesunąć pęcherzyki powietrza w górę i z dala od linii. Wstrzyknij heparynową sól fizjologiczną, aż linia cewnika będzie przejrzysta i wolna od krwi.

Zaklemuj linię tętniczą tuż poniżej łącznika rurki. Zdejmij złącze strzykawki z linii cewnika tętniczego i zastąp je stalowym korkiem do rurek. Zwolnij kleszczyki hemostatyczne zamykające zewnętrzną część cewnika tętniczego.

Powtórz tę procedurę dla linii żylnej. Ze względu na niskie ciśnienie żylne pobranie próbek może być niemożliwe. Generalnie, jeśli sól fizjologiczna z heparyną może być infundowana przy minimalnym oporze, prawdopodobnie cewnik jest prawidłowo umieszczony w żyle.

Przed rozpoczęciem procedury należy zważyć zwierzęta, przygotować roztwory oraz złożyć aparat zaciskowy. Po zważeniu zwierzęcia i potwierdzeniu drożności cewnika, należy umieścić je w niewielkim pojemniku z podścieliskiem, który ogranicza, ale nie blokuje ruchów. Szczury wykorzystane w tym badaniu są głodzone przez co najmniej pięć godzin i spełniły wymogi dotyczące przyrostu masy ciała po operacji. Masa ciała szczura określa tutaj wymaganą ilość insuliny.

Dawkę 4 mU/kg/min podaje się z szybkością 2 µL/min. Należy przygotować 50% roztwór dekstrozy i upewnić się, że ilość obu roztworów wystarczy na około dwie godziny; używa się do tego strzykawek o pojemności 3 mL. Teraz można przystąpić do montażu aparatu zaciskowego.

Przygotuj linie i pompy infuzyjne zgodnie z przedstawionym schematem. Umieść strzykawki z glukozą i insuliną w pompie strzykawkowej. Zaklemuj linie i pozostaw szczura do odpoczynku na 30 minut przed rozpoczęciem eksperymentu.

Aby rozpocząć procedurę, pobierz wyjściową próbkę insuliny oraz hematokrytu; pomiar hematokrytu zapewnia utrzymanie objętości krwi w trakcie całego eksperymentu. Zazwyczaj poziom hematokrytu nie powinien spaść o więcej niż 10% wartości początkowej. Pobierz wyjściową próbkę glukozy i określ poziom glukozy do zaklemowania.

W tym przypadku utrzymujemy poziom glikemii na poziomie 5 mM. Po pobraniu każdej próbki krwi należy przepłukać linię tętniczą niewielką objętością soli fizjologicznej z dodatkiem 10 j./ml heparyny, aby zapobiec krzepnięciu. Po ustaleniu poziomu glukozy do utrzymania należy rozpocząć wlew roztworu insuliny.

Pomierz poziom glukozy we krwi w odstępach od 5 do 10 minut i dostosuj szybkość infuzji glukozy w razie potrzeby, aż do osiągnięcia stanu stacjonarnego. Jest to zazwyczaj proces prób i błędów, który może zająć od 30 minut do ponad dwóch godzin. Poziom glukozy wymagany do utrzymania glikemii zależy od protokołu eksperymentalnego.

Gatunki i warunki: aby uznać poziom glukozy za ustabilizowany (clamped), trzy kolejne pomiary muszą zmieścić się w określonym zakresie. Trzy odczyty różniące się od siebie o około 1 mmol/L oznaczają, że poziomy glukozy osiągnęły stan stacjonarny. Prędkość infuzji glukozy wymagana do utrzymania glikemii przez okres 30 minut; w tym czasie można pobrać co najmniej dodatkowe próbki krwi.

Po zakończeniu procedury clampowania należy pobrać drugą próbkę hematokrytyczną insuliny w osoczu. Zwierzęta mogą zostać wykorzystane do dalszych badań lub poddane eutanazji w celu pobrania tkanek do dalszej analizy. W zależności od zwierzęcia, przy prawidłowym wykonaniu, wkłucia cewników mogą pozostać drożne od pięciu do siedmiu dni.

Procedura clamp pozwala na pomiar wrażliwości na insulinę w stanie stacjonarnym. Niezbędne jest monitorowanie poziomów insuliny i glukozy, a także szybkości wlewów glukozy oraz wartości hematokrytu. Stan stacjonarny zostaje osiągnięty, gdy poziomy glukozy utrzymują się w granicach jednego milimola względem siebie w okresie 30 minut.

Szybkość wlewu glukozy wskazuje poziom egzogennej glukozy niezbędny do utrzymania glikemii; w miarę możliwości szybkość ta powinna być naniesiona na wykres w funkcji czasu, a nie przedstawiona jako pojedynczy punkt średni. Należy podać poziomy insuliny zarówno na czczo, jak i w fazie zaciskania (clamping). Pomiary te potwierdzają prawidłowe podanie insuliny i pozwalają wykryć wszelkie różnice w odpowiedzi insulinowej pomiędzy grupami badawczymi. Pomiar poziomu hematokryty wyjściowo oraz ponownie po zakończeniu procedury daje pewność, że poziomy te nie spadły o więcej niż 5% wartości wyjściowej w trakcie trwania eksperymentu po zastosowaniu tej procedury.

Do oceny wykorzystania glukozy w całym organizmie oraz w konkretnych tkankach można zastosować inne metody, takie jak podawanie znaczników izotopowych.