Izolacja mitochondriów z mięśni szkieletowych

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyizolowanie mitochondriów i przeprowadzenie pomiaru oddychania mitochondrialnego. Cel ten osiąga się poprzez wstępne wyizolowanie mięśni szkieletowych od szczurów utrwalonych metodą suszenia rozpyłowego. Następnie mięśnie poddaje się homogenizacji, a mitochondria izoluje za pomocą wirowania.

Następnie stężenie białka określa się za pomocą metody Bradforda. Na koniec, oddychanie mitochondrialne mierzy się za pomocą poligrafii. W rezultacie można uzyskać wyniki obrazujące zużycie tlenu w różnych stanach oddychania mitochondrialnego.

Ta metoda może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie mięśni szkieletowych, takie jak wpływ różnych interwencji na funkcję mitochondriów. Choć metoda ta pozwala na uzyskanie wglądu w metabolizm mięśni szkieletowych, może być ona również zastosowana do innych organów, takich jak wątroba, mózg, nerka lub niemal każda tkanka. Przed rozpoczęciem procedury, w celu izolacji mięśni szkieletowych, należy przygotować następujące roztwory: PBS, PBS z dodatkiem 10 mM EDTA, bufor do izolacji mitochondriów 8x, bufor do izolacji 1 (IB1), bufor do izolacji 2 (IB2) oraz bufor eksperymentalny (EB).

Instrukcje znajdują się w towarzyszącym protokole pisemnym. Następnie włącz wirówkę i ustaw temperaturę na 4 °C. Włącz łaźnię wodną i ustaw ją na 37 °C.

W odpowiednim pojemniku, w lodzie, umieść trzy zlewki o pojemności 10 ml, tłuczek porcelanowy, homogenizatory do tkanek, małe nożyczki chirurgiczne oraz 10 probówek do mikrocentryfugi. Wszystkie elementy muszą pozostać schłodzone przez cały czas trwania eksperymentu. Umieść IB one i IB two w lodzie, a EB w ciepłej łaźni wodnej.

Następnie dodaj następujące roztwory do trzech zlewków znajdujących się w lodzie: do zlewka pierwszego 10 milliliters PBS, do zlewka drugiego 10 milliliters PBS-EDTA, do zlewka trzeciego 3 milliliters ib. 1. Uśmierć szczura zgodnie z procedurami zatwierdzonymi przez lokalną instytucjonalną komisję ds. etyki eksperymentów na zwierzętach.

Następnie szybko wyizoluj od 250 do 500 miligramów mięśnia szkieletowego za pomocą pęsety i nożyczek Mayo. Przepłucz go w beczce jeden, a następnie przenieś do beczki dwa, aby zhomogenizować mięsień. Najpierw przenieś go do beczki trzy, a na koniec posiekaj nożyczkami.

Przenieś roztwór do homogenizatora Potter-Elva i homogenizuj mięsień za pomocą zmechanizowanego tłuczka 10 razy, przez cały czas utrzymując probówkę w lodzie. Następnie przenieś homogenat do schłodzonych wcześniej probówek do mikrocentryfugi o pojemności 2 mL i wiruj przy 700 Gs przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Przenieś supernatant do nowej, schłodzonej wcześniej probówki do mikrocentryfugi, a pellet wyrzuć.

Odwirować supernatant przy 10 500 G przez 10 minut w temperaturze 4°C, przenieść supernatant do nowej, wcześniej przygotowanej probówki do mikrowirówki i oznaczyć ją jako SN 1 oraz podać typ mięśnia. Resuspender osad w 500 µl buforu IB 2, następnie odwirować przy 10 500 G przez 10 minut w temperaturze 4°C. Przenieść supernatant do nowej, wcześniej przygotowanej probówki do mikrowirówki i oznaczyć ją jako SN 2 oraz podać typ mięśnia.

Resuspenduj końcowy osad mitochondrialny w 100 µL buforu IB dwa. Wiruj w miniwirówce przez kilka sekund. Jeśli powstanie osad, przenieś nadsącz do nowej, wcześniej przygotowanej probówki do mikrocentryfugi i odrzuć osad. Kalibracja elektrody tlenowej jest kluczowym krokiem w tym protokole i musi być wykonywana codziennie.

Kalibrację elektrody można przeprowadzić podczas izolacji mitochondriów. Aby rozpocząć, należy dodać 100 ml wody destylowanej do kolby o pojemności 250 ml i intensywnie mieszać przez 20 minut. W celu wyrównania stanu wody z gazami atmosferycznymi, należy pokryć elektrodę GRAT kilkoma kroplami 50% chlorku potasu.

Następnie umieść mały kawałek niebieskiego papierka do skręcania rizla na elektrodzie. Następnie połóż kawałek membrany PTFE na papierku do skręcania.

Za pomocą aplikatora do pierścieni nałóż pierścień wewnętrzny, a następnie umieść pierścień zewnętrzny w rowku elektrody. Podłącz elektrody i zmontuj większą plastikową podstawę pierścienia, komorę mitochondrialną oraz węże wodne. Włącz urządzenia GRAT i uruchom oprogramowanie GRAS.

Dodaj wyrównaną wodę do komory mitochondrialnej. Następnie włóż mieszadło magnetyczne i włącz mieszanie. Kliknij w sekcję sprzętu (hardware).

Następnie uruchom mieszanie. Ustaw prędkość na 60 i kliknij potwierdzenie. Następnie rozpocznij nowy eksperyment.

Kliknij opcję calibrate, a następnie liquid phase calibration. W polu pierwszym zmień temperaturę na 37 °C i dwukrotnie kliknij okay. Gdy pole override zmieni się na okay, kliknij je i otwórz butlę z azotem.

Umieść końcówkę połączoną ze zbiornikiem z azotem w komorze i wytwórz warunki zerowego poziomu tlenu. Kliknij OK, gdy system przełączy się z trybu pominięcia (override). Odessij wodę i dodaj 500 µL buforu EB do komór mitochondrialnych.

Uszczelnij komorę za pomocą tłoka. W przypadku użycia wielu pudełek powtórz czynności od etapu kalibracji dla każdego pudełka. Rozpocznij nowy eksperyment i pozwól mu trwać przez około jedną minutę.

Aby ustabilizować sygnał, dodaj odpowiednią objętość zawiesiny mitochondriów, aby uzyskać 150 µg w każdej komorze. Oznacz zdarzenie i kontynuuj pomiar. Przez jedną minutę dodawaj 10 µL podgrzanego roztworu 250 mM glutaminianu i 125 mM malonianu, aby uzyskać końcowe stężenie 5 mM glutaminianu oraz 2,5 mM malonianu; oznacz ten moment i kontynuuj pomiar przez jedną minutę.

Definiuje się to jako stan drugi. Następnie należy dodać 7,5 µL 10 mM a DP, aby uzyskać stężenie końcowe 150 µM. Następnie należy oznaczyć i pozostawić do przebiegu przez 30 sekund.

Zostaje to zdefiniowane jako stan trzeci. Dodaj kolejne 7,5 µL 10 mM ADP, a następnie inkubuj przez 1,5 minuty. Dodaj 0,5 µL schłodzonej 10 mM oligomycyny, aby uzyskać końcowe stężenie 1 µM, i inkubuj przez trzy minuty.

Stan ten definiuje się jako stan czwarty. Należy dodać 1 µL zimnego FCCP o stężeniu 0,1 mM, aby uzyskać stężenie końcowe 0,2 µM, a następnie pozostawić RUM na trzy minuty. Stan ten definiuje się jako stan piąty.

Po zakończeniu zakończ eksperyment i zapisz go. Pobierz wartości tempa oddychania za pomocą oprogramowania raft. Wprowadź czynnik normalizacji.

W przypadku dodania 150 µg białka mitochondrialnego, czynnik normalizacji wyniesie 0,15. Oblicz znormalizowane tempo oddychania dla różnych stanów oddychania. Oblicz współczynnik kontroli oddychania (RCR), dzieląc wartość dla stanu trzeciego przez wartość dla stanu czwartego.

Rysunek ten przedstawia reprezentatywny zapis zużycia tlenu przez mitochondria mięśni szkieletowych. Po ustabilizowaniu sygnału z elektrody, próbkę mitochondriów dodaje się do komory GRAT. Stan drugi, oddychanie rozpoczyna się po dodaniu glutaminianu i jabłczanu.

Dodatek ADP zwiększa zużycie tlenu. Definicja stanu trzech. Oddychanie ATP syntazy zostaje zablokowane poprzez dodanie oligomycyny w celu uzyskania oddychania w stanie czwartym.

Na koniec dodaje się FCCP w celu rozprzęgnięcia oddychania mitochondrialnego. Ten schemat przedstawia reprezentatywne tempo zużycia tlenu dla stanów 2, 3, 4 i 5. Dla każdego eksperymentu obliczany jest współczynnik kontroli oddechowej lub RCR.

Wartość RCR większa od czterech jest uważana za dowód na otrzymanie żywej preparacji mitochondriów. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby próbki mitochondriów przez cały czas przechowywać w lodzie. Po wykonaniu tej procedury.

W celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, np. dotyczące zawartości białek mitochondrialnych, można przeprowadzić inne metody, takie jak Western blot. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak izolować mitochondria z mięśni szkieletowych, a także na temat oddychania mitochondrialnego.