Ustanowienie hodowli embrionalnych neuralnych komórek macierzystych myszy z wykorzystaniem testu neurosferowego
11 stycznia 2011
Niniejszy protokół wideo demonstruje zastosowanie testu neurosfer do izolacji i ekspansji komórek macierzystych mózgu z eminencji zwojowych mózgu myszy w 14. dniu embrionalnym.
Celem niniejszego protokołu wideo jest izolacja i ekspansja komórek macierzystych układu nerwowego z embrionalnego mózgu myszy z wykorzystaniem testu neurosfer. Procedura obejmuje pobranie embrionów myszy w 14 dniu rozwoju (E 14), a następnie mikrodysekcję mózgu w celu wyizolowania wybrzuszeń zwojowych, dysocjację pobranej tkanki w celu uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek i na koniec wysianie komórek do hodowli neurosfer. Cześć, jestem Hassan Ali z laboratorium dr. Brenta Frennelsa w Instytucie Mózgu Uniwersytetu Florydy.
Dzisiaj pokażę Państwu, jak prowadzić hodowlę neurosfer z zarodkowego mózgu myszy przy użyciu testu neurosfer. W naszym laboratorium rutynowo stosujemy tę metodę do izolacji i namnażania komórek macierzystych układu nerwowego. Zatem zacznijmy.
Zanurz w znieczuleniu czasowo zapłodnioną mysz w ciąży. W 14. dniu gestacji wykonaj zwichnięcie szyi i opłucz brzuch 70% etanolem. Chwyć skórę nad brzuchem za pomocą dużych pęsety, a następnie przetnij skórę i leżącą pod nią powięź dużymi nożyczkami.
Aby odsłonić jamę brzuszną i rogi macicy, należy usunąć rogi macicy zawierające zarodki i przenieść je do probówki stożkowej o pojemności 50 ml zawierającej zimny hem. Po przeniesieniu tkanek macicy do komory z laminarnym przepływem powietrza klasy II, należy usunąć hem z probówki 50 ml i wypłukać tkanki wystarczającą ilością świeżego zimnego hemu, aby usunąć zanieczyszczenia, takie jak krew i sierść; należy powtórzyć ten proces dwa do trzech razy. Następnie tkanki macicy należy przenieść do szalki Petriego o średnicy 10 cm zawierającej zimny hem.
Otwórz rogi macicy za pomocą małych zakrzywionych pincet i nożyczek, a następnie przenieś zarodki do nowej szalki zawierającej zimne hem. Powtarzaj tę procedurę, aż wszystkie zarodki zostaną pobrane. Następnie umieść zarodki pod mikroskopem stereoskopowym.
Oddziel głowy embrionów na poziomie rdzenia kręgowego szyjnego i przenieś je do innej szalki Petriego zawierającej zimny hem. Przytrzymaj głowę za pomocą precyzyjnych zakrzywionych pęsety i użyj mikronoareczek. Najpierw wykonaj cięcie poziome powyżej nosa, a następnie kontynuuj cięcie w linii środkowej od czoła w stronę tyłu głowy.
Należy upewnić się, że nacięcie przechodzi przez skórę i czaszkę, nie uszkadzając leżącego pod nimi mózgu. Wyjąć mózg z czaszki, przesuwając krawędzie naciętego fragmentu ruchem wstecznym za pomocą pęsety zakrzywionej. Powtarzać tę procedurę aż do momentu usunięcia wszystkich mózgów z czaszek.
Przytrzymaj mózg nieruchomo za pomocą zakrzywionej pincety tak, aby strona grzbietowa była skierowana do góry, a następnie za pomocą mikronozyciórek przetnij korę każdej półkuli od cebulek węchowych do tylnej części półkuli. Aby odsłonić eminencje zwojowe, trzymając mózg w jednej pozycji, wypreparuj całą eminencję zwojową za pomocą pincety kątowej 45 stopni i przenieś ją do innej szalki Petriego. Eminencja zwojowa jest tutaj wyraźnie pokazana wraz z jej częścią przyśrodkową i boczną.
Alternatywnie można wypreparować grudki zwojowe, usuwając otaczające tkanki za pomocą precyzyjnej pęsety. Można również przeciąć całą grudkę na połowę przyśrodkową i boczną, jeśli planuje się hodowlę komórek z któregokolwiek z tych obszarów.
Powtarzaj tę procedurę, aż wszystkie mózgi zostaną poddane mikrodysekcji. Użyj 1 ml pożywki dla neuralnych komórek macierzystych, aby zebrać fragmenty tkanki i przenieść je do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Pozostaw grudki tkanki w probówce 15 ml do osadzenia, aby nie pominąć żadnego fragmentu tkanki.
Odssać część medium znad osadu i wypłukać dno szalki Petriego, aby przenieść resztę tkanki do probówki o pojemności 15 ml. Umieścić końcówkę pipety przy dnie probówki. Kilkakrotnie (od trzech do czterech razy) pobierać i wydmuchiwać zawiesinę, aby rozbić tkankę i uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek.
Następnie pozostawić zawiesinę na jedną minutę, aby niepowiązane grudki osiadły, a następnie przenieść prawie całą zawiesinę komórkową do kolejnej probówki o pojemności 15 ml. Do pozostałych grudek dodać jeden mililitr pożywki dla neuronowych komórek macierzystych i rozbić je do pojedynczych komórek. Zebrać zawartość probówek.
Następnie odwiruj zawiesinę z prędkością 700 RPM lub przy 110 G przez pięć minut. Usuń nadsącz i ponownie zawieś komórki w 1 ml pełnej pożywki dla neuronowych komórek macierzystych. Pobierz 10 µL zawiesiny komórkowej i dokładnie wymieszaj z 90 µL błękitu trypanowego.
Następnie pobierz 10 µL tej zawiesiny i przenieś ją do komory licznikowej (hemocytometru). Wykonaj zliczenie komórek. Przenieś łącznie 20 ml pełnej pożywki dla neuralnych komórek macierzystych do probówki stożkowej o pojemności 50 ml, aby zasiać jedną kolbę T 80.
Następnie wymieszaj zawiesinę komórkową i dodaj odpowiednią liczbę komórek, aby uzyskać całkowitą gęstość 200 000 komórek na mililitr lub 4 miliony komórek na kolbę T 80. Dodaj EGF do końcowego stężenia 20 nanogramów na mililitr. Wymieszaj komórki znajdujące się w pełnej pożywce dla neuralnych komórek macierzystych z czynnikiem wzrostu, a następnie przenieś zawiesinę komórkową do kolb T 80.
Oznakuj kolbę i obejrzyj komórki pod mikroskopem, aby upewnić się, że otrzymano zawiesinę pojedynczych komórek bez grudek tkanki. Przenieś kolbę do inkubatora w temperaturze 37 °C z 5% CO2 na okres od pięciu do siedmiu dni. Po pięciu do siedmiu dniach oceń stan komórek w kolbie pod mikroskopem.
Do tego czasu neurosfery powinny już powstać, osiągnąć średnicę od 150 do 200 mikronów i być gotowe do pasażowania. Przenieść zawartość kolby do sterylnej probówki do hodowli tkanek o odpowiednim rozmiarze, odwirować probówkę i usunąć supernatant. Resuspendować sfery w 1 ml podgrzanej trypsyny i umieścić probówkę w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C na dwie minuty.
Następnie dodać taką samą objętość inhibitora trypsyny i dokładnie, lecz delikatnie wymieszać, aby zatrzymać działanie trypsyny. Ponownie odwirować i usunąć supernatant. Następnie resuspenderć komórki w 1 ml kompletnego medium dla neuralnych komórek macierzystych i przeprowadzić liczenie komórek zgodnie z wcześniejszymi opisami. W celu wysiania komórek do jednej kolby T175, przenieść łącznie 40 ml kompletnego medium dla neuralnych komórek macierzystych do probówki stożkowej o pojemności 50 ml.
Następnie wymieszaj komórki i dodaj odpowiednią ich liczbę, aby uzyskać całkowitą gęstość 50 000 komórek na M lub 2 milionów komórek na kolbę T 1 75. Następnie dodaj EGF do stężenia końcowego 20 nanogramów per mil. Wymieszaj komórki znajdujące się w pełnej pożywce dla neuralnych komórek macierzystych z czynnikiem wzrostu, a następnie przenieś zawiesinę komórkową do kolby T 1 75.
Oznakuj kolbę i przenieś ją do inkubatora na okres od pięciu do siedmiu dni. Jest to przykład pierwotnej hodowli komórek macierzystych układu nerwowego E 14. Strzałki wskazują proliferujące skupiska komórek macierzystych układu nerwowego trzy dni po wysiewie.
Można również zauważyć komórki przytwierdzone do podłoża, które uległy różnicowaniu. Jest to przykład pierwotnej hodowli neuroblastów z zarodka E 14 siedem dni po wysianiu. Jak widać, obecne są sfery o różnych rozmiarach.
Występują również komórki zróżnicowane. Ilość zanieczyszczeń jest znacznie mniejsza niż w przypadku pierwotnych sfer neuronowych dorosłych osobników. Ponadto sfery nie są zbite i posiadają mikrokolce na obwodzie, co świadczy o tym, że sfery są zdrowe i żywotne.
Nie należy dopuścić do nadmiernego wzrostu sfer, ponieważ mogą one przybrać ciemny kolor na skutek obumarcia komórek w ich centrum. Duże sfery mogą również przytwierdzać się do podłoża i ulegać różnicowaniu. Jest to przykład neurosfer E 14 z pierwszego pasażu pięć dni po wysianiu.
Tutaj ponownie można zauważyć mikrokolce na obwodzie sfer. Przedstawiliśmy sposób hodowli neurosfer z wyrostków zwojowych myszy w stadium E 14, stosując te same procedury, które zostały tutaj opisane. Neurosfery można hodować również z innych obszarów mózgu, takich jak kora mózgowa i śródmózgowie.
Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w hodowli neurosfer.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół wideo demonstruje zastosowanie testu neurosfer do izolacji i ekspansji komórek macierzystych neuronów z eminencji zwojowej mózgu myszy w 14. dniu embrionalnym. Procedura obejmuje pobieranie embrionów myszy E14, mikrodysekcję mózgu oraz wysiewanie komórek do hodowli neurosfer.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórek macierzystych
- Biologia rozwoju
Wstęp
- Neuronalne komórki macierzyste są kluczowe dla rozwoju i regeneracji mózgu.
- Wyrzut ganglionarny jest istotnym źródłem tych komórek podczas rozwoju embrionalnego.
- Test neurosfer umożliwia izolację i ekspansję neuronalnych komórek macierzystych in vitro.
- Technika ta jest powszechnie stosowana w badaniach nad właściwościami neuronalnych komórek macierzystych.
Cel badania
- Wyizolowanie komórek macierzystych układu nerwowego z embrionalnego mózgu myszy.
- Namnożenie tych komórek do dalszych badań i zastosowań.
- Zaprezentowanie testu neurosfer jako niezawodnej metody hodowli komórek macierzystych.
Zastosowane metody
- Pobieranie embrionów myszy w 14. dniu rozwoju (E14).
- Mikrodysekcja mózgu w celu wyizolowania wypukłości zwojowych.
- Dysocjacja tkanki w celu otrzymania zawiesiny pojedynczych komórek.
- Wysiew komórek w warunkach hodowli neurosfer.
Główne wyniki
- Skuteczna izolacja komórek macierzystych neuronów z grudek zwojowych.
- Utworzenie kultur neurosfer z możliwością ich namnażania.
- Wykazanie żywotności i proliferacji izolowanych komórek.
- Potencjał do dalszych zastosowań w badaniach nad neuronauką.
Wnioski
- Test neurosfer jest skuteczną metodą izolacji i namnażania neuralnych komórek macierzystych.
- Niniejszy protokół może być wykorzystywany w różnych warunkach badawczych.
- Dalsze badania mogą służyć do eksploracji potencjału różnicowania tych komórek.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Test neurosfer umożliwia izolację i ekspansję embrionalnych neuronalnych komórek macierzystych myszy, zapewniając odnawialne źródło komórek multipotencjalnych do wczesnej walidacji celów w OUN oraz badań mechanistycznych. Niezawodna hodowla neurosfer zapewnia wiarygodność predykcyjną w modelach neuronalnych istotnych dla przebiegu chorób, co ułatwia podejmowanie decyzji z uwzględnieniem ryzyka w procesach odkrywania leków ukierunkowanych na neurobiologię. Zdolność ta stanowi podstawę ciągłości translacyjnej – od etapu odkryć po badania przedkliniczne w ramach portfolio medycyny regeneracyjnej i neurodegeneracji.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie biologii komórek macierzystych neuronów oraz mechanizmów szlaków sygnałowych w kontrolowanym systemie in vitro.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów terapeutycznych poprzez dostarczanie multipotencjalnych prekursorów neuronalnych do dalszych analiz.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego w badaniach nad celami w OUN dzięki powtarzalnym badaniom ekspansji i różnicowania.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zestandaryzowane kultury neuronalnych komórek macierzystych do ilościowego przesiewania związków oraz testów fenotypowych.
- Gwarantuje powtarzalność i skalowalność testów opartych na komórkach neuronalnych w procesach wysokoprzepustowych.
- Umożliwia przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych do wiarygodnej oceny związków neuroaktywnych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z istotnymi dla danej choroby modelami neuronalnymi w celu odkrywania i walidacji translacyjnych biomarkerów.
- Zapewnia ciągłość od wczesnej fazy odkrywania do walidacji przedklinicznej w programach koncentrujących się na OUN.
- Zmniejsza ryzyko biologiczne, umożliwiając predykcyjną ocenę różnicowania i żywotności neuronów.
Integracja potoków i przepływów pracy
Test neurosfer pozycjonuje hodowlę neuralnych komórek macierzystych na styku wczesnego etapu odkrywania i badań przedklinicznych, wspierając procesy badawcze od weryfikacji hipotez po identyfikację związków wiodących w poszukiwaniu leków na schorzenia ośrodkowego układu nerwowego.
- Biologia odkrywcza: Zapewnia platformę do testowania hipotez dotyczących szlaków rozwoju i różnicowania neuronów.
- Screening: Dostarcza powtarzalnych, ilościowych wyników do oceny związków w kontekście neuronalnym.
- Analityka: Umożliwia pomiar tworzenia się, wielkości i żywotności neurosfer jako ilościowych odczytów.
- Badania translacyjne: Łączy badania in vitro nad neuralnymi komórkami macierzystymi z modelami przedklinicznymi in vivo w celu dopasowania biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy zasób neuralnych komórek macierzystych do ponownego wykorzystania w wielu projektach odkrywczych i walidacyjnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów terapeutycznych OUN.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje procedury pracy z neuralnymi komórkami macierzystymi w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności w różnych zespołach.
- Wartość strategiczna: Poprawia jakość decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową w portfelach neurobiologicznych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój programów odkrywania leków w obszarze OUN.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w preparatyce embrionalnego mózgu oraz w technikach hodowli neuralnych komórek macierzystych.
- Wymaga dostępu do sterylnych pomieszczeń do hodowli tkankowych oraz aparatury do ilościowego zliczania komórek.
- Konieczna jest standaryzacja gęstości komórek, suplementacji czynnikami wzrostu oraz warunków hodowli pomiędzy zespołami.
- Zgodnie z protokołem może być wymagana adaptacja metody dla różnych obszarów mózgu lub etapów rozwoju.
- Niezbędne jest uważne monitorowanie wielkości i żywotności neurosfer, aby zapobiec różnicowaniu lub śmierci komórek.
