Ilościowe oznaczenie dsDNA przy użyciu spektrofotometru fluorescencyjnego Hitachi F-7000 i barwnika PicoGreen
5 listopada 2010
Demonstracja ilościowego oznaczenia dsDNA przy użyciu barwnika PicoGreen firmy Molecular Probes oraz spektrofotometru fluorescencyjnego Hitachi F-7000 wyposażonego w akcesorium do odczytu mikropłytek.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest zaprezentowanie możliwości spektrofotometru fluorescencyjnego F 7 000 z czytnikiem mikropłytek do ilościowego oznaczenia dwuniciowego DNA przy użyciu barwnika Pico Green. Jest to realizowane poprzez przygotowanie próbek i odczynników, a następnie konfigurację instrumentu.
Trzecim krokiem procedury jest umieszczenie próbek w czytniku mikropłytek. Ostatnim etapem procedury jest wykonanie pomiaru standardów i próbek. W rezultacie można uzyskać liniową krzywą kalibracyjną, która może zostać wykorzystana do kwantyfikacji dwuniciowego DNA w próbach o nieznanym stężeniu.
Włącz fluorymetr Hitachi F 7, 000 Spectra, aby lampa ksenonowa mogła się rozgrzać przez jedną godzinę. Utwórz w programie Excel plik zawierający dane standardów i próbek, a następnie zapisz go w formacie wartości rozdzielonych przecinkami (CSV). Aby skonfigurować fluorymetr, najpierw kliknij przycisk „method”, który otwiera okno metody analizy.
W polu pomiaru wybierz z menu rozwijanego opcję fotometria. Następnie kliknij kartę ilościowa. W polu typu ilościowania wybierz długość fali, aby wskazać, że odczyt fluorescencji zostanie wykonany przy określonej długości fali.
W polu typ kalibracji wybierz pierwszy rząd, a w polu liczba długości fal wybierz jedną. Jako jednostkę stężenia wprowadź nanogramy na mililitr. Upewnij się, że pola kalibracja ręczna oraz wymuszenie krzywej przez zero nie są zaznaczone. W polu liczba cyfr po przecinku wybierz dwie, dla dolnego limitu stężenia wprowadź zero, a dla górnego limitu stężenia wprowadź 10 000.
Następnie kliknij kartę urządzenia i w polu trybu danych wybierz fluorescencję. Upewnij się, że pole prędkości rąbania jest nieaktywne, ponieważ służy ono wyłącznie do pomiarów fosforescencji. W polu trybu długości fali wybierz opcję WL fixed w polu ex WL, a w polu EM WL wprowadź 480 nanometrów.
Wprowadź wartość 520 nanometrów. Pozostaw wszystkie pozostałe pola w sekcjach EX i EM nieaktywne. Ustaw szerokość szczeliny wzbudzenia (ex slit) oraz szczeliny emisyjnej (EM slit) na 5.0 nanometrów.
Korzystając z menu rozwijanych, pozostaw nie zaznaczone pole przed polem napięcia PMT 1000 voltów. Dla napięcia PMT wybierz z menu rozwijanego wartość 700 voltów. Wybierz również wartość dwa dla auto statistic calc number, jeden dla replicates, 0.1 seconds dla integration time oraz zero dla delay.
Teraz otwórz zakładkę monitor i ustaw pole max dla osi Y na 10 000 oraz pole min dla osi Y na zero. Następnie zaznacz pole po lewej stronie opcji open data processing after data acquisition oraz, jeśli jest to wymagane, pole po lewej stronie opcji print report after data acquisition, aby raport został wydrukowany automatycznie po zakończeniu odczytów. Na koniec, aby zapisać wszystkie wybrane parametry w różnych zakładkach okna metody analizy, kliknij zakładkę general i zapisz plik pod nową nazwą w określonej lokalizacji.
Kliknij przycisk OK, aby zamknąć to okno. Tym samym kończy się konfiguracja parametrów testu urządzenia. Aby skonfigurować czytnik mikropłytek, kliknij przycisk MPR, aby przenieść okno konfiguracji MPR na pierwszy plan.
W pierwszej kolejności wybierz dołki dla standardów. Na przykład kliknij pozycję A1 i przeciągnij myszą do E1. Następnie kliknij przycisk ustawiania standardów.
To działanie spowoduje zaznaczenie pozycji przeznaczonych dla wzorców, które zostaną podświetlone na kolor zielony. Następnie należy wybrać pozycje dla próbek. W podobny sposób należy kliknąć i przeciągnąć myszą nad odpowiednimi pozycjami na płytce, a następnie kliknąć przycisk zestawu próbek, co automatycznie podświetli wybrane pozycje na kolor żółty.
Powtarzaj tę samą operację dla pozycji wybranych pomiarów próbek. Aby wczytać informacje o standardach i próbkach do wcześniej przygotowanego pliku zmiennych rozdzielanych przecinkami, kliknij kartę informacji o dołkach (well information) w oknie konfiguracji MPR.
Wybierz przycisk ładowania informacji o dołkach, po czym otworzy się okno Eksploratora Windows, aby zidentyfikować plik dot csv z informacjami o dołkach. Po załadowaniu informacji okno powinno wyświetlić się w formie tabeli. Aby przygotować roztwór roboczy odczynnika Pico green, dodaj 50 µL 200 X odczynnika pico green do 9,95 mL buforu TE.
Do przygotowania krzywej standardowej należy sporządzić rozcieńczenia szeregowe dwuniciowego DNA Lambda w buforze TE, aby uzyskać stężenia końcowe w zakresie od 1 do 100 ng/ml. Następnie należy nanieść 150 µl każdego standardu do odpowiednich dołków płytki 96-dołkowej. Kolejnym krokiem jest naniesienie 150 µl każdej próbki testowej do odpowiadających im dołków płytki. Następnie, używając pipety wielokanałowej, należy dodać 150 µl roztworu PicoGreen do każdego dołka, a następnie wymieszać roztwór z próbkami DNA.
Inkubuj delikatnie płytkę w ciemnym miejscu przez dwie do pięciu minut, aby reakcja mogła zajść. Kliknij przycisk ekranu wyświetlacza MPR, aby okno konfiguracji MPR pojawiło się na wierzchu ekranu, a następnie kliknij przycisk pozycji wymiany. Platforma trzymająca mikropłytkę przesunie się w stronę przedniej części instrumentu; otwórz drzwiczki czytnika mikropłytek i umieść płytkę 96-dołkową na platformie trzymającej tak, aby dołek A1 był skierowany do przodu, a następnie zamknij drzwiczki czytnika mikropłytek.
Kliknij przycisk pozycji początkowej, aby umieścić pozycję A mikropłytki w pozycji pomiarowej. Kliknij przycisk wyświetlacza monitora, aby przenieść okno pomiarowe na wierzch ekranu. Kliknij przycisk pomiaru, aby rozpocząć pomiar standardów i próbek nieznanych.
Poprawność krzywej kalibracyjnej ocenia się za pomocą różnych parametrów dostarczanych przez oprogramowanie F 7, 000. Na przykład, ta idealna krzywa kalibracyjna otrzymana dla ilościowego oznaczenia dwuniciowego DNA z użyciem barwnika Pico Green posiada obliczony współczynnik determinacji wynoszący 0,99993. Opisany system wysokoprzepustowy stanowi seryjny zespół technologii, obejmujący barwnik Pico Green, spektrofotometr fluorescencyjny Hitachi F 7, 000 wyposażony w czytnik mikropłytek oraz program komputerowy do automatyzacji zbierania, przechowywania, analizy i prezentacji danych.
Połączenie potężnych technologii może odpowiedzieć na rosnącą potrzebę dokładnej analizy niewielkich ilości dwuniciowego DNA.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia metodę ilościowego oznaczania dwuniciowego DNA (dsDNA) z wykorzystaniem barwnika PicoGreen oraz spektrofotometru fluorescencyjnego Hitachi F-7000 z czytnikiem mikropłytek. Procedura opisuje przygotowanie próbek, konfigurację urządzenia oraz procesy pomiarowe w celu uzyskania liniowej krzywej kalibracyjnej do kwantyfikacji dsDNA.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Spektroskopia fluorescencyjna
- Kwantyfikacja DNA
- Technologia czytników mikropłytek
Wstęp
- Barwnik PicoGreen jest czułym barwnikiem fluorescencyjnym stosowanym do ilościowego oznaczania dsDNA.
- Hitachi F-7000 to wszechstronny spektrofotometr fluorescencyjny.
- Dokładne oznaczanie ilości DNA jest niezbędne w wielu eksperymentach biologicznych.
- Systemy wysokoprzepustowe ułatwiają jednoczesną analizę wielu próbek.
Cel badania
- W celu zademonstrowania możliwości spektrofotometru F-7000 w zakresie oznaczania ilościowego dsDNA.
- W celu opracowania wiarygodnej metody pomiaru nieznanych próbek DNA.
- W celu stworzenia liniowej krzywej kalibracyjnej dla dokładnego oznaczania ilościowego.
Zastosowane metody
- Przygotowanie odczynnika PicoGreen i standardów DNA.
- Konfiguracja parametrów spektrofotometru Hitachi F-7000.
- Ładowanie próbek do czytnika mikropłytek.
- Pomiar fluorescencji w celu wygenerowania krzywej kalibracyjnej.
Główne wyniki
- Ustalono liniową krzywą kalibracyjną do oznaczania ilości dsDNA.
- Metoda wykazała wysoką czułość i dokładność.
- Wyniki wykazały współczynnik determinacji wynoszący 0,99993.
- System skutecznie analizował niewielkie ilości dsDNA.
Wnioski
- Połączenie barwnika PicoGreen i spektrofotometru F-7000 zapewnia niezawodną metodę ilościowego oznaczania DNA.
- To wysokoprzepustowe podejście spełnia wymogi dotyczące dokładnej analizy w badaniach biologicznych.
- Metodę tę można zastosować w różnych badaniach wymagających precyzyjnych pomiarów DNA.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Dokładna kwantyfikacja dwuniciowego DNA jest podstawowym wymogiem w walidacji celów, opracowywaniu testów oraz tworzeniu modeli przedklinicznych w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym. Spektrofotometr fluorescencyjny Hitachi F-7000 z zastosowaniem barwnika PicoGreen umożliwia wysokoczułe i wysokoprzepustowe pomiary dsDNA, wspierając rzetelne tworzenie krzywych wzorcowych dla aplikacji następczych. Metoda ta zapewnia pewność prognostyczną w kwantyfikacji kwasów nukleinowych, redukując zmienność w początkowych etapach procesów odkrywania leków oraz umożliwiając skalowalne i powtarzalne generowanie danych w badaniach przesiewowych związków i badaniach biomarkerów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia precyzyjny pomiar stężeń dsDNA na potrzeby klonowania, transfekcji oraz testów walidacji celów opartych na PCR.
- Wartość operacyjna: Wspiera powtarzalne przygotowanie i kwantyfikację próbek, redukując zmienność techniczną w eksperymentach opartych na hipotezach.
- Wartość prognostyczna: Pozwala na generowanie liniowych krzywych kalibracyjnych o wysokich współczynnikach determinacji (R² > 0.999), zapewniając dokładną kwantyfikację nieznanych próbek w badaniach nad wiązaniem z celem.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Zapewnia ilościowe odczyty fluorescencji kompatybilne z formatami 96-dołkowymi w celu standaryzacji testów i miareczkowania odczynników.
- Wartość operacyjna: Umożliwia szybki pomiar 96 dołków w czasie krótszym niż 60 s przy użyciu trybu kinetycznego, co wspiera gotowość do przesiewania wysokoprzepustowego.
- Skalowalność: Oprogramowanie pozwala na zapisywanie i przywoływanie konfiguracji mikropłytek, co ułatwia spójne przygotowanie testów w różnych zespołach i projektach.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Zapewnia niezawodną kwantyfikację dsDNA do analizy biomarkerów, walidacji PCR i produkcji wektorów w modelach przedklinicznych.
- Minimalizacja ryzyka: Wysoka czułość (50 picomoli ekwiwalentu fluoresceiny) oraz szeroki zakres dynamiczny (5 rzędów wielkości) umożliwiają dokładną kwantyfikację w seriach rozcieńczeń, co ogranicza liczbę wyników fałszywie ujemnych w przypadku celów o niskiej liczebności.
- Integracja z przepływem pracy: Eksport danych do formatów Excel lub raportów umożliwia bezproblemowe przekazywanie ich do potoków bioinformatycznych i analitycznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum odkryć, od wczesnej walidacji celu, poprzez identyfikację związku wiodącego, aż po rozwój przedkliniczny, w którym dokładna kwantyfikacja kwasów nukleinowych jest niezbędna dla powtarzalności eksperymentalnej i integralności danych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez umożliwienie precyzyjnego pomiaru dsDNA w celu oceny wydajności klonowania, analizy ekspresji genów oraz badań nad mutagenezą.
- Screening: Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki fluorescencji, które wspierają odporność testów i normalizację bibliotek związków.
- Analityka: Generuje liniowe krzywe kalibracyjne i współczynniki determinacji (R²), które umożliwiają porównywanie międzyeksperymentalne oraz kontrolę jakości.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną dzięki niezawodnej kwantyfikacji DNA w formulacjach leków, wektorach wirusowych i testach biomarkerów.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Konfigurowalne oprogramowanie i zestandaryzowane protokoły umożliwiają ponowne wykorzystanie metod między wydziałami, co redukuje konieczność ich ponownego opracowywania i zwiększa efektywność operacyjną.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Wysoka czułość i swoistość względem dsDNA redukują fałszywe sygnały i zwiększają wiarygodność danych w analizach molekularnych.
- Wartość operacyjna: Zautomatyzowane gromadzenie, przechowywanie i prezentacja danych za pomocą oprogramowania minimalizują ręczną obsługę i błędy transkrypcji.
- Wartość strategiczna: Niezawodna kwantyfikacja wspiera decyzje typu go/no-go w optymalizacji wiodących związków, zapewniając dokładne dawkowanie i normalizację w testach funkcjonalnych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez dostarczenie wiarygodnych danych o kwasach nukleinowych niezbędnych do wyboru kandydatów i badań nad formulacją.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest znajomość spektroskopii fluorescencyjnej oraz obsługi czytnika mikropłytek.
- Niezbędny jest dostęp do spektrofotometru Hitachi F-7000 z akcesorium w postaci czytnika mikropłytek i kompatybilnego oprogramowania.
- Wymagane jest zestandaryzowane przygotowanie odczynników (rozcieńczenie PicoGreen w buforze TE) oraz odpowiednia obsługa próbek w celu uniknięcia gaszenia fluorescencji.
- Procedura obejmuje optymalizację czasu inkubacji (2–5 minut w ciemności) oraz ustawień długości fali (Ex 480 nm, Em 520 nm) dla zapewnienia spójności sygnału.
- Ograniczenia praktyczne obejmują konieczność inkubacji w ciemności oraz ryzyko zakłóceń spowodowanych zanieczyszczeniami lub rozpuszczalnikami organicznymi.
