Identyfikacja wpływu mutacji BRCA1 na rekombinację homologiczną z wykorzystaniem komórek wykazujących endogenną ekspresję BRCA1 typu dzikiego

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest przetestowanie specyficznych wariantów białka BRCA1 z wykorzystaniem in vitro testu rekombinacji homologicznej. Osiąga się to poprzez zastąpienie endogennego białka BRCA1 typu dzikiego testowanym wariantem za pomocą transfekcji zarówno krótkiego interferującego RNA specyficznego dla BRCA1, jak i plazmidu służącego do reekspresji testowanych białek wariantowych BRCA1 w komórkach; w drugim kroku, oprócz plazmidu do ekspresji białka ICN1, który wywołuje uszkodzenia DNA w specyficznym miejscu genomu DNA komórki testowej, wprowadzane są krótki interferujący RNA oraz plazmid do ekspresji zmutowanego BRCA1. Następnie komórki inkubuje się przez dwa do trzech dni, aby umożliwić wystąpienie uszkodzeń DNA i ich naprawę; wyniki uzyskane na podstawie analizy cytometrycznej przepływowej komórek wykazujących ekspresję GFP wskazują, czy specyficzne warianty białka BRCA1 funkcjonują w naprawie DNA poprzez rekombinację homologiczną.

Technika ta łączy dwie uznane metody w celu stworzenia wszechstronnego systemu do analizy specyficznych wariantów białek w procesie naprawy uszkodzeń DNA poprzez rekombinację homologiczną. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest fakt, że wcześniejsze podejścia opierały się na liniach komórkowych z genetycznym nokautem BRCA1. Wykorzystujemy łatwiejszą w obsłudze linię komórkową pochodzącą z komórek HELOC, która umożliwia wyciszenie BRCA1 poprzez interferencję RNA endogennego białka oraz ponowne wprowadzenie białka testowego do tych komórek.

Po ekspresji wariantu białka BRC1 możemy przeprowadzić test rekombinacji homologicznej. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności ze względu na nadmierną śmierć komórek podczas procedury. Ważne jest, aby starannie dobrać warunki transfekcji, tak aby zmaksymalizować efekt reakcji rekombinacji przy jednoczesnym ograniczeniu cytotoksyczności.

Przed rozpoczęciem niniejszego protokołu linia komórkowa hela DR 13 została utworzona poprzez transfekcję komórek hela plazmidem P-D-R-G-F-P. Linię komórkową utrzymywano na 10 centymetrowych szalkach Petriego w pożywce z purmycyną w celu selekcji stabilnie transfektowanych komórek. Substrat rekombinacyjny w plazmidzie P-D-R-G-F-P oraz w stabilnych transformantach zawiera dwa nieaktywne allele GFP. Jeden allel jest nieaktywny ze względu na obecność 18 par zasad stanowiących miejsce rozpoznawania przez enzym restrykcyjny I-SceI.

W swojej sekwencji kodującej ekspresja I-SceI w tych komórkach powoduje powstanie pęknięcia dwuniciowego DNA (DSB) w drugim allelu nieaktywnego GFP. Fragment jego sekwencji skorelowany z miejscem I-SceI w pierwszym allelu jest typu dzikiego. Ten drugi allel GFP może pełnić funkcję donora sekwencji dla naprawy DSB poprzez rekombinację homologiczną, co prowadziłoby do powstania aktywnego allelu GFP, który jest łatwo wykrywalny za pomocą cytometrii przepływowej w dniu poprzedzającym pierwszą transfekcję.

Przygotować szalkę o średnicy 10 cm z komórkami HeLa DR 13 o konfluencji co najmniej 90%. Potraktować komórki trypsyną w ilości 1 ml przez 2 do 3 minut. Przerwać reakcję poprzez dodanie 9 ml DMEM-FBS i dokładnie wymieszać zawiesinę komórkową za pomocą pipety. Przenieść 40 µL trypsynizowanych komórek do każdego dołka płytki 24-dołkowej w 0,5 ml DMEM-FBS. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez noc.

W pierwszym dniu komórki powinny osiągnąć od 40 do 50% konfluencji. Transfekcję należy rozpocząć od wymieszania siRNA służącego do wyciszenia endogennego b RCA one oraz plazmidu ekspresyjnego mutant b RCA one w podłożu Optimum.

Przeprowadzić transfekcję lipofektową zgodnie z instrukcjami producenta. Ponownie inkubować komórki. Po czterech do sześciu godzinach wymienić medium na takie, które nie zawiera antybiotyków.

W drugim dniu inkubuj komórki przez noc. Aby zneutralizować komórki, dodaj 0,3 ml odczynnika TrypLE Trypsin do każdej studzienki. Po krótkiej inkubacji w temperaturze 37 °C odklej komórki, pipetując je w górę i w dół w odczynniku trypsynowym. Gdy trypsyna zadziała, przenieś komórki z płytki 24-dołkowej do płytki 6-dołkowej zawierającej 2 ml DMEM-FBS, aby zatrzymać działanie trypsyny.

Inkubować płytkę sześciodołkową przez noc w tych samych warunkach co wcześniej, dwa dni po początkowej transfekcji. Przygotować SIR A, plazmid DNA wykazujący mutację BRCA1 oraz plazmid wykazujący ISCE1 w 62,5 µL Optum. Wymieszać ten roztwór z 2,5 µL LIPECTOMY 2060 oraz 2,5 µL Optum.

Przystąp do transfekcji komórek po czterech do sześciu godzinach inkubacji. Wymień medium na D-M-E-M-F-P-S pozbawiony antybiotyków. W szóstym dniu przenieś komórki z powrotem do inkubatora.

Potraktuj komórki w każdej studni, dodając 0,5 ml odczynnika trypsyny. Przerwij reakcję poprzez dodanie dwóch ml D-M-E-M-F-B-S. Zbierz komórki poprzez wirowanie przy 1000 RPM przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Resuspenduj komórki w jednym ml świeżego D-M-E-M-F-B-S i przeanalizuj 10 000 komórek na studnię pod kątem ekspresji GFP.

Za pomocą cytometrii przepływowej pojedyncze żywe komórki są selekcjonowane (gatowane) przy użyciu parametrów rozproszenia światła w przód (forward scatter) oraz bocznego (side scatter). Komórki wykazujące ekspresję GFP są wyodrębniane za pomocą detektora fluorescencji GFP, a wyniki przedstawione są w formie histogramu. Pozostałe komórki mogą zostać ponownie wysiane w celu wykonania zdjęć fluorescencyjnych.

Mikroskopia pożądanych komórek BRCA1 regulujących szlak naprawy pęknięć dwuniciowych DNA poprzez rekombinację homologiczną. Komórki, które przeszły naprawę drogą rekombinacji homologicznej, są łatwo wykrywane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Wyciszenie BRCA1 za pomocą RNAi prowadzi do gwałtownego spadku liczby wykrytych komórek pozytywnych pod kątem GFP.

Wynikiem analizy FCA jest histogram z intensywnością GFP na jedną komórkę na osi X oraz liczbą komórek na osi Y. W przypadku braku transfekcji plasmidu ekspresyjnego w komórkach SCE nie wykryto komórek GFP-dodatnich.

Wyniki w kolumnach od drugiej do szóstej uzyskano z komórek, w których w trzecim dniu przeprowadzono transfekcję plazmidu wykazującego ekspresję I SCE one. W typowym zestawie wyników z pojedynczego eksperymentu, 15,5% komórek jest pozytywnych pod kątem GFP po ekspresji I SCE one i kontrolnym wyciszeniu RNAi nieistotnego genu; w porównaniu z tym, wyciszenie BRCA one i dodanie pustego wektora plazmidowego zmniejszyło konwersję GFP do 0,7%. Dodanie egzogennego BRCA one typu dzikiego w pełni przywróciło rekombinację homologiczną, co wykryto poprzez uzyskanie 15 do 16% komórek pozytywnych pod kątem GFP.

Podobnie, ekspresja innego wariantu o nieznanym znaczeniu, mutacji BRCA1 21B, w pełni przywróciła zależną od BRCA1 funkcję rekombinacji homologicznej. Ponowne wprowadzenie mutanta BRCA1 M18T wywołało efekt podobny do kontroli wektorowej.

Ponieważ wariant ten był wyrażany na podobnym poziomie co białko endogenne, sugeruje to, że wariant BRCA1 M18T jest niefunkcjonalny w procesie rekombinacji homologicznej. Podczas przeprowadzania tej procedury należy pamiętać o monitorowaniu wzrostu komórek, uwzględniając fakt, że rosną one powoli i przy niskiej konfluencji, co wymaga zmniejszenia ilości użytej mieszaniny do transfekcji. Ważne jest również terminowe usunięcie medium do transfekcji.

Stwierdziliśmy, że w dniach następujących po transfekcji występuje wysoki stopień cytotoksyczności, jeśli w pożywce znajdują się antybiotyki. Z tego powodu we wszystkich pożywkach po pierwszym dniu rozwoju pominięto antybiotyki. Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie raka piersi do eksploracji genetyki wariantów BRC1 o nieznanym znaczeniu klinicznym w klinikach onkologicznych.

Mamy nadzieję, że opracowany w niniejszej pracy funkcjonalny test BRC one pozwoli na lepsze przewidywanie wpływu wariantów BRC one na predyspozycje do nowotworów.