Komputerowa wizualizacja i kwantyfikacja na dużą skalę masy wysepek trzustkowych, ich rozkładu wielkości oraz architektury

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zebranie nieobciążonych, reprezentatywnych danych z ograniczonej próby oraz precyzyjna analiza złożonej trójwymiarowej struktury tkanki. Osiąga się to poprzez najpierw wykonanie wirtualnych przekrojów immunohistochemicznie barwionych sekcji trzustki. Następnie wirtualne przekroje są kwantyfikowane za pomocą makra IHC virtual slice w oprogramowaniu ImageJ, a dane są analizowane przy użyciu skryptów napisanych dla programu Mathematica.

Następnie, przy użyciu programu Image J, przeprowadza się rekonstrukcję 3D wirtualnych przekrojów. Ostatnim etapem procedury jest wykonanie stosu obrazów poszczególnych wysepek za pomocą oprogramowania Slidebook oraz ręczne mapowanie stosów obrazów w trzech wymiarach przy użyciu programu Stereo Investigator. W rezultacie, dzięki połączeniu obrazowania 3D i ręcznego mapowania, można uzyskać precyzyjną architekturę wysepek wraz z współrzędnymi 3D dla każdej komórki wysepki. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w badaniach nad otyłością i cukrzycą, takie jak wpływ warunków fizjologicznych i patofizjologicznych na masę komórek beta trzustki, dystrybucję oraz architekturę wysepek.

Implikacje tej techniki obejmują diagnostykę lub terapię otyłości oraz cukrzycy (diabetes mellitus), ponieważ lepsze zrozumienie zmian w masie komórek beta ułatwi opracowanie i ocenę interwencji terapeutycznych. Chociaż metody opisane w niniejszej pracy dostarczają wglądu w konkretny przypadek, dynamiczna analiza immunohistochemiczna trzustki może być zastosowana również w odniesieniu do szeregu innych organizmów i tkanek. Wizualna prezentacja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy analizy wspomaganej komputerowo są trudne do opanowania.

Ze względu na złożoność analizy tak dużych zbiorów danych w dwóch i trzech wymiarach. Rozpocznij tę procedurę, umieszczając w uchwycie mikroskopu fluorescencyjnego czyste szkiełko zawierające cały przekrój trzustki poddanego immunohistochemicznemu barwieniu. Otwórz oprogramowanie Stereo Investigator i zwizualizuj próbkę, klikając opcję akwizycji.

Następnie wykonaj obrazowanie na żywo. Określ poziomy ekspozycji dla każdego kanału, korzystając z okna histogramu wideo, które wyświetla intensywność fluorescencji. W tym przykładzie kanał drugi jest używany dla DAP, kanał trzeci dla GFP, kanał czwarty dla RFP, kanał piąty dla sci five oraz kanał szósty dla SCI seven.

W oknie ustawień kamery dostosuj poziom ekspozycji tak, aby intensywność fluorescencji stopniowo spadała. Korzystając z prawej krawędzi histogramu wideo, można ustawić ostrość obrazu za pomocą pokrętła ostrości mikroskopu. Przed utworzeniem wirtualnego przekroju należy obrysować próbkę, klikając na ekranie w punkcie oddalonym od próbki, co wyznaczy punkt odniesienia.

Następnie kliknij wokół obrysu próbki, aż kontur zostanie ukończony. Kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz „close contour”, aby połączyć punkty początkowy i końcowy. Po zamknięciu konturu wykonaj wirtualny przekrój próbki, wybierając opcję „acquisition”, a następnie „acquire virtual slice”. Gdy otworzą się opcje okna wirtualnego przekroju, wybierz „high speed acquire” oraz wyłącz funkcję „manual”.

Ustaw ostrość, odznaczając pole obok opcji manual. Zapisz plik. Przeskaluj prefo, klikając prawym przyciskiem myszy i wybierając opcję dodaj do listy miejsc ostrzenia.

Ręcznie ustaw ostrość w kilku losowych sekcjach w podglądzie wirtualnego przekroju. Po ustawieniu ostrości w kilku miejscach, uruchom wirtualny przekrój, klikając prawym przyciskiem myszy i wybierając opcję Start virtual slice with prefo. Po zakończeniu wirtualnego przekroju dla pierwszej próbki, przełącz się na następny kanał i odpowiednio dostosuj czas ekspozycji. Procedurę tę powtarza się dla każdego kanału w celu przeprowadzenia kwantyfikacji eyeletów. Przetwórz obrazy za pomocą makra ImageJ o nazwie I-H-C-V-S, które najpierw przygotowuje załadowane obrazy do analizy, a następnie kwantyfikuje cechy eyeletów, takie jak skład komórkowy.

Makra I-H-C-V-S dzielą stos obrazów na poszczególne kanały kolorystyczne. W programie ImageJ każdy obraz jest konwertowany na ośmiobitową czarno-białą maskę. Po automatycznym progowaniu intensywności, obrazy z poszczególnych kanałów są sumowane arytmetycznie, tworząc maskę kompozytową.

Wbudowana w program Image J funkcja analizy cząstek zastosowana do obrazu kompozytowego zidentyfikuje następnie obszary zainteresowania (ROI), wykluczając cząstki mniejsze niż jedna komórka beta. Kwantyfikacja ROI za pomocą programu Image J pozwala na wygenerowanie arkusza parametrów komórkowych.

Zapisz zagregowane wyniki w arkuszu kalkulacyjnym Excel. Przechowuj dane, takie jak obwód obszaru, kolistość, średnica Fer oraz środek otworu dla każdego otworu, wraz z odpowiadającymi im numerami oznaczonymi na obrazie. Analizę obliczeniową tych parametrów można przeprowadzić zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Aby uzyskać informacje, w tym analizę rozkładu i częstotliwości występowania otworów, wykonaj rekonstrukcję 3D wirtualnych przekrojów, uruchamiając skrypt, który konwertuje wszystkie obrazy w formacie JPG w katalogu na pliki TIF; jest to format wykorzystywany do konstrukcji i kwantyfikacji stosów trójwymiarowych z wirtualnych przekrojów.

W tym przypadku wykorzystano skrypt o nazwie I MJ two two tiff. Skopiuj skrypt do katalogu zawierającego obrazy JP two. Uruchom skrypt w powłoce Linux, wpisując w konsoli dot slash I am JP two two TIFF, a następnie naciskając enter.

Po przekonwertowaniu wszystkich zarejestrowanych obrazów z plików JPEG2 do formatu TIFF są one gotowe do analizy w programie ImageJ. W programie ImageJ należy otworzyć wszystkie obrazy dla pierwszej próbki, która w tym przypadku pochodzi z ludzkiej trzustki płodowej, a następnie połączyć je w jeden obraz, wybierając sekwencję Image, Color, a następnie Merge Channels. Powtórz ten proces dla każdej z próbek, aż wszystkie zostaną scalone w pojedyncze obrazy. Wyczyść obrazy, zaznaczając niepożądane obszary za pomocą narzędzia Polygon Selections.

Wypełnij je, wybierając opcję edytuj, a następnie wypełnij. Przekształć każdy obraz w obraz kolorowy RGB. Na koniec utwórz stos z obrazów, które następnie można wyrównać za pomocą wtyczki stack reg.

Ostatecznie, scalenie kanałów i połączenie obrazów pozwala na stworzenie montażu 3D wszystkich wysepek w całej trzustce. Aby zebrać stosy obrazów, należy umieścić całe preparaty wysepek trzustkowych pod mikroskopem. W przypadku użycia obiektywu imersyjnego wodnego należy nanieść wodę.

Otwórz oprogramowanie slide book, a następnie przejdź do sterowania akwizycją i ostrzeniem, naciskając Ctrl+Shift+E w oknie sterowania ostrzeniem. Ustaw obiektyw na 20x lub 40x, w zależności od rozmiaru oczka. Aby zlokalizować oczka za pomocą okularu mikroskopu, ustaw bin na 2x oraz zestaw filtrów na user 1.

W oknie sterowania ostrością wybór emisji powinien zostać ustawiony na 100%Eyes, a gęstość neutralna na jedno kliknięcie GFP ey; następnie otwórz okno podglądu, aby zwizualizować próbkę w slide book, wróć do okna sterowania ostrością i przełącz zestaw filtrów na tryb fix. Następnie kliknij G-F-P-D-S. Użyj dżojstika, aby jak najlepiej wycentrować oczko w oknie kamery 1.

Ustaw ostrość na głębokość w pobliżu centrum otworu, w miejscu, gdzie komórki są łatwo dostrzegalne. W oknie sterowania ostrością wybierz zab. Użyj sterowania mikroskopem, aby przewinąć do najwyższej głębokości otworu, na której cechy są wyraźnie widoczne, a następnie kliknij „ustaw górną granicę” (set top).

Przewiń do dołu okna wyboru i kliknij ustaw. Kliknij na dole, aby przejść dalej. Aby powrócić do punktu odniesienia w oknie przechwytywania, kliknij opcję zaawansowane, a następnie przełącz tryb kanału na alternatywny.

Po prawej stronie okna ustaw współczynnik binowania (bin factor) na 2 oraz typ akwizycji (capture type) na 3D, zaznacz opcję użycia pozycji górnej i dolnej (use top and bottom positions) oraz powrotu do centralnej objętości po akwizycji (return to center volume after capture). Ustaw wielkość kroku (step size) na 3. Pod polem zestawu filtrów (filter set box) ustaw zestaw filtrów na tryb na żywo (live).

Wybierz DAP, E-D-S-U-G-F-P-D-S-U-R-F-P-D-S-U oraz pięć jednostek DSU z SCI. Dla każdego z nich kliknij „find best” w sekcji „adjust exposure”. Następnie kliknij „test”, aby upewnić się, że wybrana ekspozycja jest odpowiednia.

Kliknij start, aby rozpocząć akwizycję. Po zakończeniu akwizycji dostosuj poziomy w razie potrzeby i zmień wyświetlany kolor dla RFP na biały. Zapisz slajd i przejdź do widoku eksportu serii plików TIFF.

Wpisz nazwę preparatu, dodając myślnik na końcu, i zapisz plik. Powstanie kilkanaście indywidualnych plików TIF, dlatego pomocne może być przechowywanie stosu obrazów każdego otworu w osobnym folderze. Aby zmapować stosy obrazów, otwórz oprogramowanie Stereo Investigator.

Zwizualizuj obraz, otwierając stosy obrazów w menu skalowania obrazu. Ustaw odległość między obrazami na trzy mikrony, aby skorygować dwukrotne wygięcie. W książce slajdów wybierz opcję nadpisania skalowania X i Y oraz użyj określonego źródła dla skalowania X i Y.

Wprowadź wartość 0,65 dla środka osi X oraz Y i powiększ obraz, klikając przycisk powiększenia, a następnie w obszarze interesującej nas wyspy w oknie makro zaznacz przynajmniej jedną komórkę. Po zastosowaniu odpowiedniego markera komórki beta będą widoczne na zielono, komórki alfa na czerwono, a komórki delta na biało.

Zaznacz komórki w centrum ich jądra, które będą widoczne w kolorze niebieskim, jeśli próbka została zabarwiona DPI. Użyj Markera 2 do zaznaczenia komórek beta, Markera 5 do zaznaczenia komórek alfa oraz Markera 6 do zaznaczenia komórek delta. Po zaznaczeniu co najmniej jednej komórki wyświetl widok ortogonalny za pomocą ikony w górnym menu, zaznaczając opcje Z filter oraz symmetric.

Zakres należy ustawić na 15.00. Zaczynając od poziomu 0.0 Z, należy przesuwać się przez oczka za pomocą kółka myszy i zaznaczać każdą komórkę odpowiednim markerem; każdą komórkę należy zaznaczyć tylko raz, w centrum jej głębokości. Po zakończeniu zaznaczania wszystkich poziomów Z, można odznaczyć pole kontrolne filtra Z.

Spowoduje to wyświetlenie wszystkich markerów ze wszystkich poziomów Z. Po zaznaczeniu wszystkich komórek zapisz plik w formacie DAT. Następnie przejdź do opcji eksportu ścieżek (file export tracing).

Zapisz obrys jako plik TXT. Na koniec kliknij „new data file”, aby wyczyścić obszar roboczy przed próbą mapowania nowych oczek. Przygotowanie wirtualnych przekrojów z próbki trzustki barwionej immunohistochemicznie pozwala na jednoczesne badanie endokrynnych komórek alfa, beta i delta w całej trzustce jako wysepek; barwienie immunohistochemiczne dla insuliny widoczne jest na zielono, dla glukagonu na czerwono, dla somatostatyny na biało, a dla DAP na niebiesko.

Następnie obrazy przekształcono w maski ośmiobitowe po zastosowaniu automatycznego progowania. Przedstawiony tutaj obraz jest kompozytem po nałożeniu kanałów. Jednakże rozkład oczek z wykorzystaniem wirtualnych przekrojów pozwala również na indywidualną analizę w osobnych kanałach.

Poniżej przedstawiono widoki każdego kanału, aby ukazać komórki delta, komórki beta oraz komórki alfa. Przeprowadzono analizę cząstek na podstawie maski kompozytowej, w której każda struktura oczka została ponumerowana i zaznaczona na niebiesko. Wynikiem analizy cząstek masek kompozytowych jest tabela danych zawierająca takie parametry jak powierzchnia wysp, obwód, kołowość oraz różne średnice dla każdego wykrytego oczka, których identyfikatory odpowiadają ponumerowanym etykietom na masce kompozytowej.

Analiza tych obrazów na dużą skalę pozwala na wyznaczenie całkowitej liczby wysepek oraz histogramów rozkładu wielkości, a także na szczegółowe porównanie powierzchni komórek alfa, beta i delta. Mapowanie wysepek oraz analiza matematyczna składu i architektury komórkowej umożliwiają wyodrębnienie pojedynczej płaszczyzny ogniskowej z 3D zrekonstruowanego stosu obrazów ludzkich wysepek wczytanych do programu Stereo Investigator. Tutaj komórki beta są zaznaczone na zielono, komórki alfa na czerwono, komórki delta na biało, a jądra komórkowe na niebiesko.

Po uchwyceniu poszczególnych eyeletów, w różnych płaszczyznach poziomych zaznaczono komórki alfa, beta i delta; tutaj przedstawiono obrazy fluorescencyjne oraz odpowiadające im dane map dla trzech różnych płaszczyzn ogniskowania w odstępach 10 micronów. Po zaznaczeniu komórek alfa, beta i delta w różnych płaszczyznach, eyelet można zwizualizować w 3D. Przedstawiono tutaj rekonstrukcję 3D eyeletu przeciętego w ćwiartkach, opracowaną na podstawie współrzędnych uzyskanych podczas mapowania eyeletów.

Ponadto zautomatyzowana analiza matematyczna zmapowanych oczek może ukazać skład i architekturę komórkową. Przedstawiono tutaj względną częstość odległości międzykomórkowych dla dwóch komórek w obrębie jednej populacji komórek. Przedstawiono również względną częstość odległości międzykomórkowych między dwiema różnymi populacjami komórek.

Przedstawiono również skumulowane prawdopodobieństwa rozkładów odległości międzykomórkowych dla komórek alfa-alfa, beta-beta oraz delta-delta. Na podstawie tych prawdopodobieństw można przeprowadzić test Kołmogorowa-Smirnowa (KS), aby uzyskać odpowiadające im dystanse KS. Po opanowaniu tej metody obrazowanie i analiza całego przekroju tkanki w dużej skali mogą zostać wykonane w ciągu czterech godzin.

Rekonstrukcja 3D bloku tkanki może zostać wykonana w 30 minut. Ostatecznie obrazowanie 3D i mapowanie ręczne mogą zostać ukończone w ciągu czterech godzin, jeśli zostaną przeprowadzone prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby rozpocząć od wysokiej jakości barwienia immunohistochemicznego przekrojów.

Dokładność późniejszej analizy będzie zależeć od danych surowych. Należy również upewnić się, że komputery posiadają co najmniej osiem gigabajtów pamięci RAM, aby móc przeprowadzić tak wielkoskalową analizę. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom nie tylko w dziedzinie otyłości i cukrzycy, ale szeroko w wielu innych dziedzinach wykorzystujących standardową analizę patologiczną.

Może to być szczególnie przydatne w sytuacjach, gdy dostępność próbek jest ograniczona. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak zbierać nieobciążone, reprezentatywne dane przy ograniczonej liczbie próbek, stosując standardowe techniki. Wybór tylko jednego konkretnego obszaru może nie być reprezentatywny dla całego obrazu, co wykazaliśmy w naszym badaniu rozkładu wysepek trzustkowych.