Interferencja RNA u kleszczy

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zaprezentowanie techniki interferencji RNA u kleszczy poprzez wstrzyknięcie. Osiąga się to najpierw poprzez syntezę dwuniciowego RNA genu lub genów będących przedmiotem zainteresowania. Następnie RNA jest wstrzykiwane kleszczom, po czym są one przetrzymywane w komorze wilgotnościowej przez 24 godziny.

Po tym okresie przetrzymania kleszcze są dopuszczane do żerowania na zwierzęciu, np. owcy. Następnie określane są parametry żerowania, takie jak masa ciała, linienie i pozycja jaj oraz poziom ekspresji docelowego genu lub genów zainteresowania za pomocą real-time R-T-P-C-R. W rezultacie można uzyskać dane wykazujące wpływ wyciszenia wybranych genów na biologię kleszczy poprzez ocenę parametrów biologicznych kleszczy oraz ekspresji genów za pomocą real-time R-T-P-C-R.

Nasz zespół pracuje z kleszczami, starając się scharakteryzować zdarzenia molekularne na styku kleszcz-patogen, aby wykorzystać te podstawowe informacje do opracowania metod kontroli infestacji kleszczami oraz transmisji patogenów na ludzi i zwierzęta. Interferencja RNA stała się niezbędnym narzędziem w tych badaniach, ponieważ jest to jedyna dostępna metoda manipulacji genetycznej kleszczy. Funkcja wielu genów kleszczy pozostaje nieznana.

Interferencja RNA pozwala nam zdefiniować rolę genów kleszczy oraz ekspresję genów w wielu aspektach biologii kleszczy, w tym w procesach kojarzenia, rozmnażania, żerowania, trawienia, funkcjonowania gruczołów ślinowych oraz w kompetencji kleszczy jako wektorów w transmisji patogenów. Procedurę zaprezentuje zespół ds. interferencji RNA u kleszczy z naszego laboratorium: dr Ed Lewin, student studiów doktoranckich, Busby oraz ja. Aby wygenerować dwuniciowy RNA, należy najpierw zsyntetyzować startery oligonukleotydowe zawierające sekwencje promotora T7 do transkrypcji RNA in vitro.

Na przykład, derma center vari lesin. Należy użyć starterów oligonukleotydowych D eight A a T 75 oraz D eight DVT 73 przedstawionych tutaj. Amplifikację genu docelowego należy przeprowadzić metodą RT-PCR, wykorzystując 10 pmoli każdego startera oligonukleotydowego oraz od 1 do 10 ng całkowitego RNA kleszcza.

Następnie należy oczyścić produkt PCR. Potem użyj 8 µL lub około 100 ng w celu syntezy dwuniciowego RNA. Aby przygotować kleszcze do iniekcji, najpierw przemyj je w następującej serii roztworów: woda z kranu, 3% nadtlenek wodoru, dwukrotnie woda destylowana, 70% etanol oraz dwa końcowe płukania wodą destylowaną.

Każde płukanie należy przeprowadzić w jednorazowej probówce wirówkowej o pojemności 50 mililitrów poprzez wstrząsanie. Następnie roztwór należy odlać przez drobne sito z drucianej siatki. Kleszcze należy osuszyć na ręcznikach papierowych, a następnie podzielić na grupy po 20 do 50 osobników, w zależności od planowanego eksperymentu.

Każdą grupę umieść w plastikowym kubku o pojemności 1,25 uncji z dopasowaną pokrywką i oznacz każdy kubek zgodnie z grupą eksperymentalną. Następnie sformuj zespół RNAi składający się z trzech osób, które przeprowadzą proces iniekcji. Pierwsza osoba umieszcza każdego kleszcza na dwustronnej taśmie klejącej przytwierdzonej do arkusza czerwonego wosku dentystycznego o wymiarach trzy na sześć cali.

Druga osoba wykonuje iniekcje kleszczom, a trzecia monitoruje je po wstrzyknięciu, wydmuchuje dwutlenek węgla na kleszcze w celu ich aktywacji, a następnie zlicza i przenosi żywe osobniki do kubków oznaczonych numerem grupy eksperymentalnej. Wszyscy członkowie zespołu muszą nosić jednorazowe rękawiczki. Aby rozpocząć proces iniekcji kleszczy, należy chwycić kleszcza za pomocą precyzyjnej pęsety Dumonta i umieścić go stroną brzuszną do góry na dwustronnej taśmie klejącej przytwierdzonej do arkusza czerwonego wosku dentystycznego. Kleszcze należy ułożyć blisko siebie w grupach po pięć osobników. Na części gębowe wszystkich pięciu kleszczy należy nałożyć wąski pasek taśmy maskującej.

Aby dodatkowo je unieruchomić, pozostaw większość ciała odsłoniętą, tak aby osoba wykonująca wstrzykiwanie mogła obserwować proces iniekcji. W celu wstrzyknięcia preparatu kleszczowi, wykonaj otwór w dolnym prawym kwadrancie brzusznej powierzchni egzoszkieletu, używając jednorazowej strzykawki insulinowej z igłą 29G o długości pół cala. Następnie niezwłocznie wstrzyknij kleszczom od 0,2 do 0,5 µl roztworu dwuniciowego RNA, używając specjalnie wykonanej strzykawki Hamiltona z igłą 33G o długości jednego cala i ściętym pod kątem 45 stopni wierzchołkiem; wprowadź igłę głęboko do wnętrza kleszcza, aby zapewnić prawidłowe umieszczenie i zatrzymanie dwuniciowego RNA.

Mimo że po wstrzyknięciu następuje wyciek płynu, głębokie wprowadzenie igły zapewni odłożenie do jam ciała kleszcza wystarczającej ilości dwuniciowego RNA, aby wywołać wyciszenie genu; należy jednak uważać, aby nie wstrzyknąć zbyt dużej objętości, co spowodowałoby utratę hemolimfy i śmierć kleszcza. Natychmiast po wstrzyknięciu należy zebrać kleszcze z dwustronnej taśmy klejącej za pomocą precyzyjnej pęsety i umieścić je w plastikowym pojemniku regeneracyjnym.

Kleszcze pozostaną przez krótką chwilę nieaktywne po wstrzyknięciu, lecz wkrótce powinny zacząć pełzać po szalce. Aktywuj kleszcze, wydmuchując na nie dwutlenek węgla. Gdy kleszcze zaczną pełzać i staną się aktywne, rana po wstrzyknięciu szybko się zagoi i najprawdopodobniej przeżyją.

Należy policzyć kleszcze w każdej grupie eksperymentalnej i umieścić każdą grupę w oznakowanym plastikowym kubku z dopasowaną szczelnie pokrywką. Kleszcze, które padną w aktualnej grupie, należy zastąpić przed wykonaniem iniekcji w następnej grupie eksperymentalnej. Strzykawkę Hamiltona należy oczyścić przed iniekcją w następnej grupie eksperymentalnej poprzez napełnienie, a następnie opróżnienie jej świeżym 3% nadtlenkiem wodoru.

15 razy, a następnie 15 razy płukać sterylną wodą. Należy uważać, aby nie wygiąć tłoka strzykawki Hamiltona, w przeciwnym razie tłok nie będzie poruszał się płynnie i nie będzie reagował na delikatny nacisk wymagany podczas wstrzykiwania kleszczom. Po wstrzyknięciu umieścić kleszcze na jeden dzień w komorze z pojemnikiem wypełnionym wodą i siarczanem potasu, co zapewni im wysoką wilgotność.

Następnie umieść poszczególne kleszcze w komórkach do żywienia przyklejonych do owcy i pozwól im żywić się wraz z równą liczbą niezatrzymanych kleszczy samców lub samic, w zależności od tego, która płeć nie została poddana zastrzykowi. Zbierz i zważ kleszcze samice z komórki do żywienia po zakończeniu żywienia, co trwa około 10 dni, lub w momencie, gdy samice kontrolne opadły z żywiciela. Inkubuj każdą grupę kleszczy w komorze wilgotnościowej aż do zakończenia składania jaj. Oceń składanie jaj dla każdej grupy poprzez zważenie masy jaj wyprodukowanych przez wszystkie kleszcze w grupie, aby ocenić fenotyp kleszczy po żywieniu.

Określ liczbę kleszczy, które przeżyły, a następnie oblicz masę kleszczy, pozycję jaj oraz ich płodność. W zależności od wybranego genu i celów badania można przeprowadzić dodatkowe analizy w celu potwierdzenia wyciszenia genu za pomocą R-T-P-C-R. Po karmieniu wypreparuj gruczoły ślinowe i jelita z poszczególnych kleszczy z grup kontrolnej (wstrzykniętej) oraz grupy wstrzykniętej dwuniciowym RNA, a następnie wyizoluj całkowite RNA z poszczególnych próbek tkanek.

Przeanalizuj transkrypty genu docelowego w poszczególnych tkankach metodą real-time R-T-P-C-R i znormalizuj poziomy RNA względem 16 s RNA rybosomalnego kleszcza. Stosując metodę gen norm, przeprowadź analizę krzywych dysocjacji na końcu reakcji, aby upewnić się, że powstał tylko jeden amplikon i że amplikony denaturują konsekwentnie w tym samym zakresie temperatur dla każdej próbki, a następnie porównaj znormalizowane wartości CT dla poziomów mRNA między kleszczami wstrzykniętymi kontrolnie a kleszczami wstrzykniętymi dwuniciowym RNA, wykorzystując test t Studenta.

Protokół opisany w niniejszym opracowaniu był stosowany w naszym laboratorium do RNAi u wielu różnych gatunków kleszczy. Ilość dwuniciowego RNA wstrzykiwanego do kleszczy zależy od wielkości osobnika. Większe gatunki kleszczy mogą przyjąć większą objętość.

Bibliografia znajduje się w towarzyszącej pisemnej części protokołu. Jeśli protokół zostanie przeprowadzony prawidłowo, śmiertelność wynikająca z procedury iniekcji po 24 godzinach powinna być niższa niż 5%. Przedstawiono tutaj typowy fenotyp po wyciszeniu genów u kleszczy, w którym panel kleszczy został poddany iniekcji pulami dwuniciowego RNA wykorzystanego do przesiewania ochronnych antygenów kleszczy.

W kleszczach badanych za pomocą mikroskopii świetlnej można zaobserwować degenerację komórkową w tkankach. Zmiany fenotypowe mogą być również powiązane z utratą funkcji. Na przykład, RNAI genu SUBIN prowadzi do powstania sterylnych samców, które nie są w stanie skutecznie kopulować z samicami po zastosowaniu interferencji RNA u kleszczy.

Do określenia wpływu wyciszania genów na ekspresję genów i białek oraz na biologię kleszczy można wykorzystać inne metody, w tym R-T-P-C-R w czasie rzeczywistym, mikroskopię świetlną, elektronową lub konfokalną, genomikę lub proteomikę. Interferencję RNA można przeprowadzić również w kulturach komórek kleszczy, co stanowi metodę in vitro do badania interakcji między komórkami kleszczy a patogenami.