Pomiary elektrofizjologiczne z systemu węchowego ćmy

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest zademonstrowanie łatwości rejestrowania odpowiedzi węchowych z układu nerwowego owada. Osiąga się to poprzez unieruchomienie żywej ćmy i podłączenie elektrod do czułka lub pojedynczego neuronu w celu zarejestrowania odpowiedzi indukowanych przez substancje zapachowe. W pierwszym kroku szklaną elektrodę wypełnioną roztworem soli fizjologicznej wprowadza się do oka jako elektrodę uziemiającą, a w drugim kroku do unieruchomionej ćmy wprowadza się szklaną elektrodę wypełnioną roztworem soli fizjologicznej, co umożliwia rejestrację odpowiedzi elektrycznych w formie antenogramu w celu zarejestrowania odpowiedzi pojedynczych jednostek z neuronu receptora węchowego.

Elektrodę rejestrującą wprowadza się do podstawy organu zapachowego. Następnie sygnał z anteny jest wzmacniany i przekazywany do przetwornika analogowo-cyfrowego w celu rejestracji i zapisania sygnałów. Uzyskane wyniki wykazują zależne od dawki odpowiedzi indukowane przez odoranty, na podstawie zarejestrowanego sygnału elektrycznego w formie sygnału EAG lub potencjału czynnościowego.

Opracowaliśmy nową metodę rejestracji enterogramu z unieruchomionej żywej ćmy z gatunku Naval orange. Główną zaletą tej techniki jest długotrwała stabilność preparatu, co pozwala na wielokrotne wykorzystanie tej samej ćmy do rejestracji wielu odpowiedzi, a także do zapisu odpowiedzi pojedynczych jednostek z konkretnego sensora anteny. Skupiliśmy się na gatunku Naval orange, ponieważ jest on istotny dla rolnictwa w Kalifornii.

Niemniej jednak, metodę tę można zastosować w przypadku innych owadów z grupy epi dotter, nie tylko w celu odpowiedzi na fundamentalne pytania dotyczące funkcji zapachowych, ale również w opracowywaniu nowych atraktantów. Niniejsze badanie systemu olfaktorycznego ciem wykorzystuje omacnicę pomarańczową Ullo Ella.

Kolonię owadów utrzymuje się na diecie z otrębów pszennych w komorach klimatycznych w temperaturze około 28 °C, przy wilgotności względnej około 75% oraz w 16-godzinnym cyklu światła i 8-godzinnym cyklu ciemności. Przygotowuje się pojemniki dla nowo wyklutych ciem, umieszczając w plastikowym pudełku do 10 warstw nasączonych wodą ręczników papierowych. Codziennie zbiera się i określa płeć wykluwających się ciem, a następnie przenosi je do plastikowego pudełka. Pudełko przykrywa się perforowaną pokrywą, aby zapewnić cyrkulację powietrza przed przystąpieniem do rejestracji elektrofizjologicznej.

W pierwszej kolejności przygotuj uchwyt dla ćmy, odcinając końcówkę pipety o pojemności 200 µL tak, aby średnica otworu wynosiła około dwóch milimetrów. Do badania EAG lub SSR wybierz ćmę, która wykluła się od dwóch do czterech dni temu. Za pomocą zwilżonego fragmentu ręcznika papierowego wprowadź ćmę do pipety od strony przeciwnej do końcówki, delikatnie przesuwając owada w kierunku wierzchołka pipety.

Kontynuuj wpychanie ćmy, aż czułki i część głowy wystaną z końcówki; unieruchom odsłoniętą głowę, pokrywając ją nieutwardzającą się glinką, pozostawiając odsłoniętą niewielką część jednego oka i dwa czułki. Umieść preparat ćmy na platformie mikromanipulatora elektrogramu pomiędzy dwoma uchwytami elektrod, używając elektrod szklanych o średnicy końcówki poniżej 1 µm. Wypełnij elektrody roztworem Centum limb ringer.

Patrząc przez mikroskop, przebij jedną elektrodą odsłonięty obszar oka. Służy ona jako elektroda referencyjna. Kolejnym krokiem jest umieszczenie elektrod rejestrujących na antenach.

Czułek samca ćmy z gatunku naval orangeworm jest wieloczłonowy, a każdy człon ozdobiony jest licznymi strukturami przypominającymi włoski. Illa, wstawka przedstawia mikrografię elektronową skaningową ukazującą szczegóły illa w celu ułatwienia rejestracji sygnałów z czułków. Odetnij jeden do dwóch dystalnych członów czułka.

Następnie wprowadź obie anteny do elektrody rejestrującej. Alternatywnie, w przypadku rejestracji z jednego sensa, wprowadź elektrodę rejestrującą do podstawy sensa. Potencjały czynnościowe z sensów są wzmacniane przez przedwzmacniacz o wysokiej impedancji i przesyłane do inteligentnego cyfrowo-analogowego przetwornika USB w celu analizy offline za pomocą oprogramowania autos spike.

Kolejnym krokiem jest przygotowanie bodźca chemicznego z użyciem ZZ 1113 HEXA deca Now, który jest głównym składnikiem mieszaniny feromonowej samic omidnicy pomarańczowej; należy rozcieńczyć ten związek w heksanie w celu przygotowania rozcieńczeń DIC. Nanieś 10 µL roztworu bodźca na papier filtracyjny Whatman. Odparuj rozpuszczalnik, delikatnie potrząsając nim przez 10 sekund.

Pod wyciągiem przystawnym umieść pasek w pięciomililitrowej strzykawce z polipropylenu; sama heksan oraz pusta strzykawka służą jako kontrole preparacji. EAG lub SSR utrzymuje się w nawilżonym strumieniu powietrza dostarczanym przez kontroler bodźców z prędkością 20 milliliters per second. Podłącz strzykawkę zawierającą bodziec chemiczny do kontrolera strumienia powietrza.

Nagraj dwie sekundy sygnałów elektrycznych w warunkach bazowych. Następnie podaj impuls stymulujący o natężeniu 4 mL/s do strumienia powietrza (Airstream) przez 500 ms. Kontynuuj rejestrację sygnałów elektrycznych przez kolejne osiem sekund.

Zachowaj co najmniej jedną minutę przerwy między stymulacjami. Rysunek ten przedstawia wyraźną odpowiedź zależną od dawki w czułkach unieruchomionego samca ćmy stymulowanego komponentem feromonu samicy, CZ 1113 hexaco.

Reakcja na heksan. Kontrola nośnika jest przedstawiona kolejno linią niebieską. Większe dawki feromonu generują sukcesywnie większe zapisy elektrogramów.

Rysunek ten przedstawia pozakomórkowe rejestracje pojedynczych jednostek z trichoglandulum w odpowiedzi na stymulację składnikiem feromonu żeńskiego. Rejestracje te wykazują zależną od dawki odpowiedź pobudzającą. Po opanowaniu techniki, przy prawidłowym wykonaniu, można ją przeprowadzić w ciągu kilku godzin.

Podczas stosowania tej metody należy zadbać o uniknięcie kontaminacji i używać możliwie najczystszych odczynników chemicznych.