Protokoły mutagenezy i selekcji funkcjonalnej dla ewolucji sterowanej białek w E. coli

Ogólnym celem niniejszej procedury jest stworzenie losowej biblioteki mutantów dla danej docelowej sekwencji DNA oraz szybka identyfikacja i charakterystyka mutantów przy użyciu półilościowej selekcji funkcjonalnej. Osiąga się to poprzez transformację szczepu mutatora plazmidem z jednym punktem początku replikacji zawierającym sekwencję docelową. Po wysianiu i inkubowaniu komórek przez noc, są one zbierane, a docelowy plazmid jest izolowany w celu uzyskania biblioteki mutantów; następnie biblioteka mutantów jest transformowana do szczepu odczytującego, aby scharakteryzować mutacje w drugiej części protokołu. Przygotowuje się płytkę z gradientem wzrostu, a kultury bakteryjne szczepu odczytującego nanosi się na oddzielną szalkę Petriego zawierającą miękkie agar.

Ostatnim krokiem procedury jest przeniesienie tych kultur bakteryjnych na gradient za pomocą stemplowania. W efekcie można uzyskać wyniki wykazujące zmiany w profilu fenotypowym danej sekwencji docelowej poprzez różnice w tempie wzrostu na gradiencie leku. Niniejszy film prezentuje metodę ukierunkowanej ewolucji białek w e coli.

Proces ten naśladuje naturalną ewolucję poprzez generowanie losowych bibliotek składników odżywczych, po której następuje selekcja ograniczająca tę różnorodność. W ten sposób zwiększa on naszą zdolność do generowania nowych aktywności biochemicznych do celów przemysłowych lub biomedycznych. Procedura ta składa się z dwóch etapów: generowania losowej biblioteki mutantów oraz selekcji funkcjonalnej w celu uzyskania mutacji prowadzących do zwiększenia funkcji; procedurę tę zaprezentuje Jennifer Allen, technik z mojego laboratorium.

Przed rozpoczęciem niniejszego protokołu przygotowano elektrokompetentne komórki JS 200 wykazujące ekspresję wariantu o niskiej wierności polimerazy DNA I (low fidelity pol I), zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Komórki te zawierają allel pol I wrażliwy na temperaturę, dzięki czemu w temperaturze 37 °C dominuje aktywność niskiej wierności pol I. Skonstruowano plazmid docelowy zawierający replikon coli 1 z sekwencją docelową sklonowaną w sąsiedztwie miejsca rozpoczęcia replikacji. Niska wierność pol I inicjuje replikację plazmidu coli 1, wprowadzając tym samym mutacje w celu zapoczątkowania procesu mutagenezy.

Połącz 40 µL komórek elektrokompetentnych oraz od 30 do 250 ng docelowego plazmidowego DNA w szczelinie o szerokości 2 mm. Przeprowadź elektroporację mieszaniny w elektroporatorze przy napięciu 1800 V. Sprawdź stałą czasową (TC), aby zapewnić jednorodne warunki elektroporacji dla każdej próbki.

W idealnym przypadku TC wynosi od pięciu do sześciu milisekund. Pozostaw mieszaninę DNA komórek do regeneracji w 1 ml pożywki LB przez 40 minut w temperaturze 37 °C przy wytrząsaniu z prędkością 250 RPM. Przygotuj 100 mm płytkę Petri z agarem LV, uprzednio ogrzaną do 37 °C i zawierającą odpowiednie antybiotyki do selekcji obu plazmidów; wysiej zregenerowane komórki w odpowiednim rozcieńczeniu, aby uzyskać stężenie bliskie trawnikowi, co definiuje się jako wyraźną, lecz nieliczalną liczbę kolonii, jak pokazano w tym przykładzie.

Po inkubacji nocnej zebrać kolonie bakterii z szalek Petri do bulionu LB. Wyizolować plazmidowe DNA z zebranych komórek; otrzymane plazmidowe DNA stanowi losową bibliotekę mutantów.

Przeprowadź trawienie restrykcyjne, przecinając bibliotekę plazmidów enzymem restrykcyjnym, który linearyzuje zarówno plazmid docelowy, jak i plazmid pole. Przeprowadź analityczną elektroforezę w żelu agarozowym dla wyizolowanego DNA plazmidowego, aby potwierdzić jego jakość i ilość. Po zweryfikowaniu plazmidów poddaj jeden mikrogram biblioteki trawieniu enzymem restrykcyjnym, który linearyzuje plazmid pole, ale nie przecina plazmidu docelowego.

Po zakończeniu trawienia restrykcyjnego oczyść bibliotekę za pomocą zestawu do oczyszczania DNA. Na koniec przeprowadź transformację oczyszczonej biblioteki do szczepu odczytowego w celu charakterystyki mutacji. Aby rozpocząć przygotowanie gradientu, wyznacz 10 ścieżek rozmieszczonych równomiernie wzdłuż jednej krawędzi dna kwadratowej płytki Petriego.

Umieść płytkę pod kątem tak, aby dolna zaznaczona krawędź była uniesiona o siedem milimetrów. Wlej do płytki pod kątem 25 mililitrów ciepłego agaru lb, dobrze wymieszanego z odpowiednim stężeniem czynnika selekcyjnego. Jest to dolna warstwa gradientu.

Upewnij się, że agar LB pokrywa płytkę Petriego w taki sposób, aby w podniesionym, zaznaczonym końcu płytki znajdowała się warstwa agaru LB o grubości około jednego milimetra, a w części obniżonej około ośmiu milimetrów. Przykryj płytkę pokrywką KU w celu wentylacji i pozostaw agar do zastygnięcia na 10 do 15 minut. Po stwardnieniu dolnej warstwy agaru LB przenieś płytkę na płaską powierzchnię.

Następnie wlej 25 mililitrów ciepłego agar lb bez czynnika selekcyjnego, aby pokryć pierwszą powierzchnię agaru, upewniając się, że cała warstwa spodnia została przykryta. Przykryj płytkę pokrywką KU w celu wentylacji, a następnie pozostaw agar do zastygnięcia na 10 do 15 minut przed wykonaniem transferu bakterii metodą stemplowania. Najpierw przygotuj kultury bakteryjne szczepu odczytowego i rozcieńcz je tak, aby miały identyczną gęstość komórkową przy gęstości optycznej przy 600 nanometrach poniżej 1,0.

Następnie przenieś 2 mL płynnego miękkiego agaru o temperaturze 42 °C na dno 100 mm okrągłej szalki Petriego, pipetuj 40 µL kultury bakteryjnej do miękkiego agaru, a następnie wymieszaj, kołysząc szalką. Pokryj dłuższą krawędź szklanego preparatu do mikroskopu mieszaniną miękkiego agaru. Następnie wyrównaj pokrytą krawędź szkiełka z dolnym znacznikiem na naczyniu do tworzenia gradientu.

Dotknij szkiełka powierzchni agaru. Delikatny dotyk jest wystarczający, aby przenieść smugę miękkiego agaru na powierzchnię gradientu. Następnie szkiełko odkładamy w celu oczyszczenia i ponownego użycia.

Powtórz ten proces. Pozostałe próbki oraz kontrole eksperymentalne powinny zostać umieszczone na każdej płytce gradientowej. W przypadku prowadzenia wielu gradientów, inkubuj płytkę gradientową odwróconą dnem do góry przez noc w temperaturze 37 °C; czas i temperatura inkubacji mogą się różnić w zależności od szczepów bakterii stosowanych do odczytu, jednak inkubacja przez noc w temperaturze 37 °C jest zazwyczaj wystarczająca do uzyskania widocznego wzrostu.

Na koniec wykonaj obrazowanie i przeanalizuj wzrost komórek zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Przedstawiono tutaj obrazy szczepu odczytującego po transformacji niezmodyfikowanym P-G-F-U-V lub biblioteką mutantów PG FPUV, które przeszły przez cztery rundy mutagenezy; ciemne lub słabo świecące kolonie wskazują na plazmidy zawierające mutacje inaktywujące GFP.

Rysunek ten przedstawia częstotliwość mutacji w całej neutralnej sekwencji plazmidu docelowego w odstępach 100 par zasad. Należy zwrócić uwagę, że mutacje występują w całej sekwencji plazmidu, jednak z najwyższą częstotliwością w pobliżu miejsca inicjacji replikacji. Tutaj wzrost mutantów przedstawiono w zależności od gradientu stężenia leku.

Odległość wzrostu w kierunku szczytu gradientu wskazuje na zróżnicowany profil oporności na lek wśród mutantów. W tym przykładzie biblioteki plazmidowe ludzkiej oksydacyjnej demetylazy ABH2 zostały przesiewane pod kątem mutantów o zwiększonej oporności na metanosulfonian metylu z wykorzystaniem gradientów selekcji lekiem. Przedstawiono porównanie bibliotek reprezentujących drugą i czwartą iterację protokołu mutagenezy z rodzimym typem dzikim oraz pustym wektorem.

Biała linia oznacza próg, powyżej którego izolowano poszczególne kolonie mutantów. Do dalszej analizy fenotypowej wybrano mutanty beta-laktamazy: R 1 64 H oraz E 1 0 4 KR 1 64 HG 2 67 R, zidentyfikowane wcześniej za pomocą mutogenezy P one o niskiej wierności oraz selekcji astri i m, przedstawione na gradiencie cefotaksymu o stężeniach 0.4 µg/mL i 4 µg/mL. Ochrona przed cefotaksymem świadczy o aktywności beta-laktamaz o rozszerzonym spektrum.

Należy zauważyć, że enzym beta-laktamaza typu dzikiego nie zapewnia żadnej ochrony w porównaniu z komórkami wykazującymi ekspresję pustego wektora. Zatem mutanty te reprezentują adaptację lub ewolucję nowej aktywności biochemicznej. W niniejszej pracy zaprezentowaliśmy skuteczne połączenie mutagenezy i selekcji funkcjonalnej w celu generowania nowych aktywności biochemicznych.

Selekcję funkcjonalną można przeprowadzić albo poprzez selekcję lekami, albo za pomocą komplementacji genetycznej, co pozwala wykorzystać zdolność do generowania dużej różnorodności genetycznej. Mutagenezę może być konieczne ograniczyć do określonej sekwencji w celu optymalizacji istniejącej aktywności białka lub w przypadku mutagenezy ukierunkowanej. Może to zostać łatwo osiągnięte poprzez klonowanie.

Ponadto mutagezę można oddzielić od selekcji funkcjonalnej w celu uzyskania ataków sygnaturowych lub śladów mutacyjnych.