Metoda zatapiania kolonii drożdży

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zatopienie kolonii drożdży. Osiąga się to poprzez najpierw usunięcie kolonii wraz z podstawną warstwą agaru z płytki agarowej, umieszczenie jej na kilku kroplach roztopionego agaru i szybkie przykrycie go kolejną porcją roztopionego agaru. Następnie nadmiar agaru jest odcinany od kolonii, aby była ona wystarczająco mała, by zmieścić się w formie.

Osadzoną kolonię AER następnie utrwalono, zabarwiono, odwodniono, a na koniec zainfiltrowano żywicą Spurr. Blok umieszczono następnie w formie z dodatkową ilością żywicy Spurr, inkubowano do czasu utwardzenia, a następnie wykonano skrawki. W końcowym etapie można uzyskać wyniki obrazujące rozkład typów komórek w kolonii drożdży przy użyciu mikroskopii świetlnej lub elektronowej.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak skaningowa mikroskopia elektronowa, jest możliwość określenia wewnętrznej struktury kolonii. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu rozwoju drobnoustrojów, takie jak rozmieszczenie typów komórek w obrębie kolonii. Metoda ta dostarczyła wglądu w strukturę kolonii croce CAC, jednak prawdopodobnie można ją zastosować również do innych mikroorganizmów.

Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ manipulowanie koloniami i ich zatapianie w medium mogą być trudne do opanowania na podstawie samego protokołu pisanego. Pomysł na tę metodę był zainspirowany opublikowanymi przez nas w 2002 roku danymi genetycznymi, z których wynikało, że przetrwalniki nie są równomiernie rozmieszczone w koloniach. Dostosowaliśmy metodę przekrojów kolonii opracowaną przez Engelberga w laboratorium Fin.

Zacznijmy. W pierwszej kolejności należy inkubować drożdże Wild S visi na płytkach z agarem w temperaturze 30 °C do momentu pojawienia się około 300 kolonii. Za pomocą wąskiej szpatułki należy pojedynczo pobierać z płytki kolonie o średnicy od jednego do dwóch milimetrów.

Następnie, używając końcówki do pipety o pojemności 1 ml, nanieś kilka kropli 2% agaru o temperaturze 42 °C na szkiełko przedmiotowe i niezwłocznie umieść kolonię stroną agaru do góry, zanim AER zastygnie. Nanieś kolejne kilka kropli agaru na kolonię i pozwól mu zastygnąć, upewniając się, że cała kolonia, w tym jej górna część, jest całkowicie zatopiona w agarze. We wszystkich kolejnych krokach protokołu używaj żyletki.

Wytnij blok AER wokół kolonii i umieść blok AER zawierający kolonię w fiolce z nakrętką z borokrzemianu o pojemności 3,5 ml, zawierającej utrwalacz składający się z 2% paraformaldehydu i 2% glutaraldehydu. Kolonie należy przetwarzać pojedynczo, aby zapobiec ich wysychaniu, jednak w jednej fiolce można umieścić do 10 kolonii. Pozostaw kolonie na siedem dni w temperaturze 4°C.

Po jednym tygodniu usunąć utrwalacz i dwukrotnie przemyć kolonie agri, używając około 1,5 milliliters 0,15 molar sodium Cate o pH 7,2, a po każdym przemywaniu inkubować na lodzie przez 15 minut bez mieszania. Następnie powtórzyć to przemywanie dwukrotnie.

Należy użyć 1,5 ml buforu OS 1X, składającego się z 100 mM fosforanu monopotasowego i 10 mM chlorku magnezu przy pH 6,0, inkubując na lodzie przez pięć minut po każdym przemyciu. Następnie, korzystając z tej samej probówki, należy przeprowadzić traktowanie osmem oraz etapy przemywania opisane tutaj i w pisemnej części niniejszego protokołu. Potem ponownie, w tej samej probówce, należy przeprowadzić stopniowe odwadnianie opisane tutaj oraz w towarzyszącym protokole pisemnym wczesnym rankiem następnego dnia.

Przygotować odczynnik spurs zgodnie z instrukcją przedstawioną tutaj oraz w towarzyszącym protokole pisemnym. Bezzwłocznie przemyć bloki agri pięciokrotnie, przez 10 minut każdego mycia, używając 1,5 milliliters 100% etanolu w temperaturze pokojowej. Po ostatnim płukaniu etanolem usunąć tylko tyle cieczy, aby bloki agri pozostały przykryte.

Za pomocą pipety pasteura przenieś około 0,5 milliliters odczynnika spurs do fiolki i wiruj w wirówce z niską prędkością przez 15 minut. Po wirowaniu pozostaw fiolkę w temperaturze pokojowej na 30 minut. Następnie całkowicie usuń roztwór.

Następnie należy dodać 1,5 milliliters odczynnika spurs, aby pokryć blok agri. Ponownie rotuj fiolkę na kole przez 15 minut w temperaturze pokojowej, a następnie odstaw na 30 minut. Powtórz to przemywanie.

Powtórz ten krok jeszcze trzy razy. Po ostatnim 30-minutowym okresie usuń odczynnik SPURS i dodaj świeży odczynnik SPURS, aby przykryć bloki. Pozostaw bloki agri w temperaturze pokojowej na cztery godziny.

Wymień odczynnik spurs i inkubuj w rotacji przez noc. Następnego ranka ponownie wymień odczynnik spurs i pozostaw fiolki w rotacji do następnego dnia. Kolejnego ranka wlej odczynnik spurs do ponumerowanych form silikonowych tak, aby zakryć jedynie dno form.

Następnie umieść bloki agri w formach i inkubuj w temperaturze 60 °C przez cztery godziny. Po upływie czterech godzin dopełnij formy kolejnymi porcjami medium, odczynnikiem i inkubuj w temperaturze 60 °C przez noc. Wyjmij bloki z form w celu wykonania skrawków.

Tutaj przedstawiono przykład mikrofotografii świetlnej przekroju przez środek kolonii drożdży Wild S Visia. Te drożdże stanowią szczep typu dzikiego wyizolowany z eksudatów drzewnych. Kolonia była inkubowana przez sześć dni na podłożu YNA przed wykonaniem przekroju.

Na tym obrazie łatwo można rozróżnić asai, pseudostrzyjki oraz owalne komórki drożdżowe, a także widoczny jest obszar kolonii wnikającej w podłoże agarowe. Otwarte strzałki wskazują reprezentatywne asai, wypełnione strzałki wskazują reprezentatywne owalne komórki wegetatywne, a wypełnione groty strzałek wskazują łańcuchy wydłużonych komórek i si. Ten obraz jest przykładem mikrografii elektronowej wykonanej z cienkiego przekroju szczepów laboratoryjnych drożdży SH 1 0 2 0 oraz W 3 0 3.Tło.

Kolonię inkubowano przez sześć dni na podłożu YNA przed wykonaniem przekrojów. Obraz przedstawia fragment kolonii zawierający wysoką częstotliwość komórek zasporulowanych. Strzałka wskazuje dwuwarstwową strukturę ścianki przetrwalnika.

W części A przedstawiono przekrój czterodniowej kolonii z nałożoną siatką składającą się z 15 prostokątów, widoczną na obrazie w części B. Częstość występowania komórek związanych z przetrwalnikami w każdym prostokącie wykreślono za pomocą 15 słupków odpowiadających 15 prostokątom pokazanym w części A. Dane stanowią średnią i błąd standardowy dla czterech niezależnych czterodniowych kolonii. W części C przedstawiono średnie i błędy standardowe dla czterech niezależnych ośmiodniowych kolonii. Po opanowaniu technika ta może zostać wykonana w ciągu dwóch tygodni, obejmując jeden pełny dzień oraz kilka dni po jednej do trzech godzin. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o niezwłocznym dodawaniu roztworów, aby bloki nie wyschły podczas postępowania zgodnie z tą procedurą.

Inne metody, takie jak immuno-mikroskopia elektronowa, mogłyby zostać zastosowane do określenia rozmieszczenia komórek wykazujących ekspresję konkretnych białek po ich rozwoju. Technika ta pozwoliła nam przyjrzeć się nie tylko wzorowi rozmieszczenia komórek sporulujących, ale również komórek pseudohifowych w koloniach croce CCI. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać solidną wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić inkluzję kolonii drożdży w celu ich sekcjonowania.

Należy pamiętać, że wiele odczynników do mikroskopii użytych w tym protokole może być niezwykle niebezpiecznych. Prosimy pamiętać o korzystaniu z dygestorium, noszeniu odzieży ochronnej i właściwej utylizacji odczynników. To wszystko.

Dziękujemy za oglądanie. Powodzenia w eksperymentach.