Udoskonalona wizualizacja i analiza ilościowa efektów działania leków z wykorzystaniem komórek rozmieszczonych w mikrowzorach

Ogólnym celem następującej procedury jest pokazanie, w jaki sposób normalizacja architektury i położenia komórek, osiągnięta na specyficznych adhezyjnych mikrowzorach, umożliwia łatwą automatyzację akwizycji obrazów oraz bezpośrednie przetwarzanie obrazów z czułą i wiarygodną kwantyfikacją efektów działania leków, co jest nieosiągalne na konwencjonalnych szkiełkach podstawowych. Cel ten realizuje się poprzez wysiewanie komórek heli na chipach SI two zawierających mikro-wzory w kształcie litery L oznaczone jako SI three. Komórki przyjmują kształt trójkątny, tworząc główny włókno stresowe rozciągające się między dwoma końcami litery L. Następnie komórki na wzorach inkubuje się z lebos statin lub pozostawia nieleczone, a potem utrwala i barwi w celu wizualizacji cytoszkieletu acton oraz jąder komórkowych.

Następnie wykonuje się obrazy komórek w mikrowzorach, które są przetwarzane za pomocą makra cell ref w celu wygenerowania stosu obrazów do analizy oraz makra hypotenuse w celu kwantyfikacji fenotypów. W rezultacie można uzyskać wyniki wykazujące istotny wpływ niskich dawek statyny BLE na komórki HELOC w mikrowzorach, co jest niewykrywalne w standardowych warunkach hodowli komórkowej. Cześć, witajcie.

Jesteśmy tu dzisiaj, aby przeprowadzić Państwa przez nasz protokół eksperymentalny, wyjaśniając sposób wykorzystania adhezyjnych mikrowzorów do analizy komórek, a także zaprezentować dane eksperymentalne ilustrujące łatwą kwantyfikację bardzo niskich dawek leków na tych adhezyjnych mikrowzorach. Już przy pierwszym kontakcie z tymi mikrowzorami natychmiast zrozumieją Państwo, w jaki sposób mogą one rozwiązać problemy ze zmiennością podczas rejestracji obrazów w analizie komórkowej. Dzięki zastosowaniu układu komórek przypominającego mikroarray, można łatwo przesuwać stolik mikroskopu z komórki na komórkę, co umożliwia rejestrowanie obrazów w sposób etapowy.

Oczywiście nie jest to jednak jedyna zaleta oferowana przez mikrowzory. Przynoszą one znacznie więcej ulepszeń, ponieważ w przypadku pewnych typowych mikrowzorów, takich jak kształt krzyża lub litery Y, dokonujemy w rzeczywistości normalizacji wewnętrznej architektury komórki. Oznacza to, że organelle, wrzeciono mitotyczne, cytoszkielet i różne sieci białkowe znajdują się w tych samych lokalizacjach lub są w tej samej orientacji w każdej komórce, co znacznie ułatwia przewidywanie i kwantyfikowanie wpływu leków na te konkretne wzory. Może się to wydawać dość nieintuicyjne w porównaniu z tym, co zazwyczaj wykonuje się w klasycznej szalce Petriego lub na mikropłytce.

Cóż, zazwyczaj obserwuje się oczywiście komórki, które przemieszczają się i przyjmują różne morfologie. Natomiast na adhezyjnych mikro-wzorach wszystkie komórki zaczną wyglądać podobnie, ponieważ reagują na ten adhezyjny mikro-wzór i organizują swoją architekturę w ten sam sposób. Może się to wydawać w rzeczywistości nieco sztuczne, ale gdy przyjrzeć się temu uważnie, czy szalka Petriego nie jest jeszcze bardziej sztuczna?

Ponieważ w tkankach komórki są ograniczane zarówno przez sąsiednie komórki, jak i przez macierz pozakomórkową, otrzymują one znaczną ilość informacji przestrzennych, które orientują architekturę komórki. Właśnie w tym celu stosujemy mikrowzory.

Przywracamy komórkom te informacje przestrzenne, a wszystkie komórki reagują na nie, organizując się w ten sam sposób. Ponieważ teraz wszystkie komórki wyglądają tak samo, możemy wprowadzić koncepcję komórki referencyjnej, co oznacza, że możemy uśrednić wszystkie obrazy i uzyskać pojedynczy obraz, który w rzeczywistości reprezentuje wygląd komórki w danej kondycji. Następnie można dodać lek i ponownie przyjrzeć się tej komórce referencyjnej, aby sprawdzić, jak lek ten zmodyfikował morfologię lub organizację komórki.

Umieść dwa chipy situ two pojedynczo w dwóch niezależnych dołkach płytki sześciodołkowej, upewniając się, że logo situ two jest widoczne. Chipy situ two użyte w tym doświadczeniu posiadają mikrowzory barwione FibroGen SI three i powinny być przechowywane w ciemności przed użyciem. Zbierz komórki hela, które osiągnęły około 80% konfluencji, za pomocą trypsyny i sprawdź pod mikroskopem, czy są prawidłowo odseparowane. Wirować przy 300 G przez cztery minuty, a następnie delikatnie resuspendować komórki. Policz i rozcieńcz komórki do stężenia 15 000 komórek na mililitr.

Do pożywki DMEM-F12 z niedoborem składników nanieście 60 000 komórek na dołek. Płytkę należy przesuwać jak najmniej, aby uniknąć wywołania ruchów rotacyjnych w medium, które mogłyby spowodować koncentrację komórek w centrum. Pozostawić komórki do osiadania na 10 minut pod dygestorium, a następnie przenieść je do inkubatora komórkowego.

W ciągu 10 do 20 minut w inkubatorze komórkowym komórki zaczną przylegać; po 10 minutach należy regularnie sprawdzać pod mikroskopem, czy komórki się przytwierdziły. Wymień medium komórkowe i usuń nadmiar komórek, powtarzając poniższą procedurę cztery razy. Trzymając płytkę płasko, delikatnie odessać medium z boku studni.

Należy zadbać o zachowanie odpowiedniej ilości medium, aby zapobiec wyschnięciu chipa. Dodać 4 mL PBS i aspirować, zaczynając od środka chipa. Następnie, przemieszczając się ku krawędzi dołka, aspirować większość PBS w ten sam sposób co wcześniej, a następnie sprawdzić pod mikroskopem obecność pływających komórek.

Jeśli pozostanie duża ilość komórek pływających, należy powtórzyć procedurę płukania. W przypadku obecności bardzo niewielkiej liczby komórek, należy odessać część PBS i zastąpić ją dwoma mililitrami świeżej pożywki, a następnie dwukrotnie dodać po cztery mililitry świeżej pożywki. Inkubować komórki przez trzy godziny w inkubatorze komórkowym, aby umożliwić im pełne rozprzestrzenienie się.

Stosując tę metodę, od 10 do 30% mikro-wzorów zostanie zajętych przez pojedynczą komórkę, natomiast pozostałe wzory pozostaną puste lub zostaną zajęte przez wiele komórek. Aby poddać komórki działaniu BLEs statin, należy rozcieńczyć 17 mM roztwór zapasowy leku do stężenia końcowego 5 µM w 0,1% DMSO w 4 mL medium. Dla grupy kontrolnej należy przygotować medium zawierające tylko 0,1% DMSO. Należy odessać medium komórkowe i szybko zastąpić je roztworami BLEs statin lub kontrolnymi, aby zapobiec wysychaniu chipa.

Inkubuj komórki przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C. W czasie inkubacji przygotuj bufor do cytoszkieletu. Dodaj 1 g sacharozy do 2 mL cb.

Pomaga to w zachowaniu wewnętrznych struktur komórkowych. Wymieszaj 1 mL sacharozy w buforze CB z 4 mL 5% PFA. Dodaj 2 mL roztworu PFA w sacharozie w buforze CB.

W dwóch dołkach nowej płytki 6-dołkowej. Aby utrwalić komórki, należy za pomocą pęsety podnieść chip CY dwa i umieścić go w płytce 6-dołkowej zawierającej 2 mL PFA w roztworze sacharozy CB. Inkubować komórki przez 10 minut w temperaturze pokojowej, usunąć PFA i przemyć komórki raz w PBS, a następnie przemyć komórki 2 mL 100 mM chlorku amonu przez 10 minut.

Aby zneutralizować resztkową aktywność sieciującą PFA, należy przepuścić komórki, dodając dwa mililitry PBS zawierającego 0,1% Triton X 100 na trzy minuty, a następnie przemyć je dwukrotnie PBS. Filamenty aktynowe barwi się dwoma mililitrami przeciwciał ZI sprzężonych z fluorochromem w rozcieńczeniu 1:2000 w PBS z 1,5% BSA, inkubując przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie komórki przemywa się raz dwoma mililitrami PBS. W dalszej kolejności należy zabarwić jądra komórkowe.

Dodaj dwa mililitry roztworu o stężeniu jeden miligram na mililitr w PBS i inkubuj przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Przemyj dwukrotnie dwoma mililitrami PBS. Zamontuj dwa chipy boczne na standardnym szkiełku przedmiotowym, używając od 25 do 30 mikrolitrów medium montażowego, takiego jak al.

Aby uzyskać obrazy w trzech długościach fal, stosujemy oprogramowanie do obrazowania Metamorph oraz mikroskop NIK icon eclipse T. Urządzenie wyposażono w kamerę CCD Hema Matsu oraz światłowodowy iluminator rtęciowy intens lite. W pierwszej kolejności wybieramy powiększenie 20 x.

Następnie w pasku menu otwórz akwizycję wielowymiarową, aby ustawić poszczególne parametry eksperymentu. Najpierw wskaż miejsce zapisu danych.

Ustaw liczbę długości fal na trzy, wybierz zestaw SI trzech długości fal i ustaw szkiełko z nakryciem tak, aby 12 mikrowzorów znajdowało się w centrum pola widzenia kamery. Liczba mikrowzorów widocznych w jednym polu będzie się różnić w zależności od konfiguracji kamery i obiektywu. Ustaw czas ekspozycji dla każdej długości fali oraz wykonaj autofokus.

Dla PS three utwórz dziennik uruchamiający akwizycję wielowymiarową i zapisz go jako MDA jnl. Otwórz funkcję stopnia skanowania, aby pozyskać 24 obrazy, z których każdy zawiera 12 mikro-wzorów. Wprowadź sześć kolumn i cztery rzędy z rozmiarem kroku x wynoszącym -400 micron oraz rozmiarem kroku y wynoszącym 300 micron w ustawieniach dziennika do wykonania, prześlij dziennik MDA jnl i naciśnij scan, aby rozpocząć zautomatyzowaną akwizycję 24 obrazów w trzech długościach fal.

W tym filmie wykorzystano mikrowzory w kształcie litery L, aby wywołać powstanie pojedynczego głównego włókna stresowego aktyny, które podtrzymuje nieprzylegającą część komórki, co upraszcza wizualizację i pomiar wpływu statyn na BLE w porównaniu z komórkami osadzonymi na gładkiej fibronekcynie. W celu zautomatyzowanego przetwarzania i analizy obrazów opisujemy dwa spersonalizowane makra napisane dla programu open source ImageJ; pierwsze makro wyodrębnia poszczególne komórki ze stosu surowych obrazów i tworzy komórkę referencyjną, natomiast drugie makro mierzy zapadanie się błony komórkowej.

Pierwszym krokiem jest segmentacja pojedynczych komórek z surowych obrazów. Obrazy fluorescencyjnie znakowanych mikrowzorów służą do wyznaczenia obszarów wycentrowanych na mikrowzorach, które są wycinane z obrazów dla każdej długości fali, a następnie ponownie składane w stosy dla każdej długości fali. Aby wybrać mikrowzory z pojedynczymi komórkami, makro wykrywa liczbę jąder na obrazie i eliminuje ze wszystkich stosów te, które zawierają więcej niż jedno jądro lub nie zawierają żadnego jądra.

Na koniec, wtyczka multi-stack reg do programu ImageJ jest wykorzystywana do ponownego wyrównania wszystkich zebranych obrazów oraz wszystkich kanałów w oparciu o pozycję mikrowzoru. Krok ten generuje stosy liniowe pojedynczych obrazów, które mogą być teraz wykorzystane do analizy pojedynczych komórek lub do stworzenia komórki referencyjnej. W programie ImageJ komórka referencyjna jest konstruowana poprzez wykonanie projekcji przefiltrowanych i wyrównanych obrazów ze stosu.

Można zastosować kilka metod projekcji, jednak zazwyczaj wybiera się projekcję medianową w celu wyeliminowania wartości odstających ze stosu obrazów. Komórka referencyjna jest unikalnym i użytecznym narzędziem do reprezentacji i analizy obrazu, dostępnym wyłącznie w przypadku komórek z mikrowzorami. Aby ułatwić jej badanie, stosuje się tabelę wyszukiwania (LUT), która przekształca obraz jednobarwny w kodowaną mapę częstotliwości.

Aby scharakteryzować wpływ statyn na BLE, przeanalizowano sztywność i zapadanie się komórek przy użyciu drugiego makra programu ImageJ. W skrócie, obrazy progowe mikro-wzorca L są wykorzystywane do zdefiniowania teoretycznej przeciwprostokątnej trójkątnego kształtu komórki. Następnie przeprowadza się progowanie obrazów barwienia aktyny w celu zdefiniowania kształtu komórki.

Następnie mierzy się różnicę w polu powierzchni między teoretyczną przeciwprostą a rzeczywistą wklęsłą błoną komórkową; komórki wykazujące powierzchnię znajdującą się pod teoretyczną przeciwprostą są uznawane za zapadnięte. Wpływ 5 µM BLEs statyny określono poprzez porównanie liczby zapadniętych komórek w warunkach traktowanych i kontrolnych. Przedstawiono typowe obrazy komórek w mikrowzorach L traktowanych BLEs statyną lub nietraktowanych; komórki zostały utrwalone i zabarwione w mikrowzorach.

Aktyna i jądra komórkowe są przedstawione odpowiednio w kolorach czerwonym, zielonym i niebieskim. Należy zwrócić uwagę na wpływ statyny BLEs na kształt komórek w porównaniu z warunkami kontrolnymi. Przedstawiono tutaj reprezentatywne komórki po inkubacji ze statyną BLEs lub kontrolami na czystej fibronekcynie.

Komórki utrwalono i zabarwiono; aktyna oraz jądra komórkowe są odpowiednio w kolorze zielonym i niebieskim. Należy zwrócić uwagę na podobieństwo między warunkami badanymi a kontrolnymi. Przedstawiono typowe obrazy komórek referencyjnych uzyskane z komórek traktowanych statyną BLEs lub niepoddanych działaniu leku.

Należy zwrócić uwagę na potencjał tej metody w łatwej obserwacji badanego fenotypu. Poniżej przedstawiono przykład analizy wpływu statyny BLEs na komórki z wykorzystaniem makroprzeciwprzyprostokątnej. Podczas gdy 25% komórek kontrolnych uległo zapadnięciu, wartość ta wzrosła trzykrotnie do 75% w komórkach traktowanych 5 µM statyny BLEs, co odzwierciedla osłabienie kurczliwej sieci aktyniny.

Po obejrzeniu tego materiału powinni Państwo mieć już dobrą wiedzę na temat tego, w jaki sposób adhezyjne mikrowzory rozwiązują kilka kluczowych problemów w analizie wysokoprzepływowej (high content analysis). Po pierwsze, zastosowanie adhezyjnych mikrowzorów znacznie uprościło proces rejestracji i analizy obrazów. Po drugie, mikrowzory umożliwiają wykrycie bardzo subtelnych efektów działania leków przy bardzo niskich dawkach, ponieważ zmniejszają zmienność międzykomórkową poprzez normalizację morfologii i zachowania komórek.

I wreszcie, w porównaniu do tysięcy komórek, które zazwyczaj są niezbędne do uzyskania dobrego wyniku w analizie komórkowej, przy użyciu naszej komórki referencyjnej potrzeba zaledwie kilkudziesięciu komórek, aby uzyskać wiarygodny i istotny wynik.