Gromadzenie zbiorów danych izotermicznej kalorymetrii miareczkowej o zmiennym stężeniu w celu określenia mechanizmów wiązania

Ogólnym celem tej procedury jest zidentyfikowanie odpowiedniego modelu fizycznego opisującego wiązanie makrocząsteczki z jej ligandem oraz wyznaczenie powiązanych parametrów termodynamicznych. Osiąga się to poprzez przygotowanie w pierwszym kroku roztworu zapasu makrocząsteczki za pomocą rozległej dializy. Następnie wybrany ligand rozpuszcza się w końcowym buforze dializacyjnym, a w drugim kroku wyznacza się stężenia wszystkich komponentów.

Próbki makrocząsteczek i ligandów są starannie rozcieńczane do szeregu różnych stężeń. Następnie przeprowadza się serię eksperymentów izotermicznej kalorymetrii miareczkowej (ITC) przy kilku stężeniach zarówno ligandu, jak i białka, aby w ostatnim kroku procedury uzyskać szereg izoterm ITC. Analiza globalna serii eksperymentów jest wykonywana przy użyciu różnych modeli fizycznych, a model wykazujący najlepszą zgodność ogólną zostaje uznany za prawidłowy.

Dzisiaj zaprezentuję metodę, która może pomóc w odpowiedzi na pytania z zakresu biofizyki, takie jak sposób wiązania ligandów przez cząsteczki białek, oraz dostarczyć dokładnych pomiarów parametrów wiązania, takich jak entropia i stałe asocjacji. Przed rozpoczęciem protokołu należy oczyścić badane białko; makrocząsteczką wykorzystaną w tej demonstracji jest immuno GLYCOSIDE N six prime, a subtle transferase one I lub a C six prime one I. Aby rozpocząć, należy przygotować cztery litry buforu do dializy i schłodzić go do 4 °C. Następnie należy przeprowadzić dializę niewielkiej objętości roztworu makrocząsteczki.

W tym przypadku pięć mililitrów 400 µM AAC C six prime, one eye w 1,3 litra buforu do dializy w temperaturze 4 °C. Proces ten można przeprowadzić w pomieszczeniu chłodniczym lub w lodówce, wymieniając bufor na świeży co osiem godzin i wykonując dializę łącznie trzy razy. Należy zachować końcowy roztwór po dializie.

Przefiltrować 750 mililitrów końcowego roztworu do dializy przez filtr celulozowy o wielkości porów 0,45 mikrona i przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Bufor ten, nazywany od teraz buforem roboczym, będzie wykorzystywany do płukania oraz jako rozcieńczalnik. W przypadku próbek, dokładnie wypłukać filtr strzykawkowy o wielkości porów 0,2 mikrona buforem roboczym.

Nanieś próbkę białka i przefiltruj ją. Ostrożnie zbierz próbkę do probówki stożkowej przed przechowywaniem roztworu białka, a następnie wyznacz stężenie białka za pomocą standardowego testu białkowego. W tym przypadku stężenie białka jest mierzone poprzez ABSORBENCJĘ przy 280 nanometrach, a następnie oblicza się stężenie enzymu.

Wykorzystując współczynnik ekstynkcji wygenerowany przez serwer proteomiczny EXI, należy przechowywać białko w sposób zapewniający maksymalną stabilność długoterminową. AAC C six prime one eye musi być przechowywane w temperaturze 4 °C, ponieważ traci aktywność po zamrożeniu i rozmrożeniu. Następnie rozpuszczono ligand oraz bufor do prowadzenia analizy. W tej demonstracji 4 mg acetylo-koenzymu A rozpuszczono w 200 µL buforu do prowadzenia analizy, aby przygotować roztwór stokowy o stężeniu 25 mM.

Ligand ten można przechowywać w temperaturze -78 °C do momentu przygotowania próbek do ITC. Najpierw należy obliczyć stężenie enzymu, aby uzyskać wartość C równą 64, zgodnie z opisem w protokole pisemnym dla AAC 6'1. Odpowiada to stężeniu 192 µM. Należy przygotować 2 ml roztworu makrocząsteczki o tym stężeniu, rozcieńczając roztwór zapasowy przefiltrowanym buforem roboczym. Rozmrozić roztwór acetalu koenzymu A w kąpieli wodno-lodowej. Po rozmrożeniu roztworu acetalu koenzymu A należy go delikatnie wymieszać. Obliczyć stężenie roztworu liganda, mnożąc stężenie makrocząsteczki przez liczbę miejsc wiązania i przez 10.

Przygotować roztwór acetylo-koenzymu A, dodając 80 µL roztworu stokowego 25 mM acetylo-koenzymu A do 420 µL buforu roboczego i wymieszając. Przenieść rozcieńczony roztwór acetylo-koenzymu A do probówki do napełniania pipety, a pozostałą część roztworu stokowego 25 mM odłożyć do przechowywania w temperaturze -78 °C. Odgazować roztwory AC6'1I oraz acetylo-koenzymu A pod próżnią przez pięć minut w temperaturze 19 °C, co stanowi 1 °C poniżej pożądanej temperatury roboczej eksperymentu.

Aby przygotować strzykawkę do iniekcji, należy wsunąć ją do uchwytu strzykawki, aż zamontowany wcześniej zacisk strzykawki znajdzie się na tej samej wysokości co uchwyt. Nasunąć drugi zacisk strzykawki na strzykawkę do iniekcji, aż zostanie on mocno dociśnięty do spodu uchwytu strzykawki. Delikatnie dokręcić zacisk za pomocą dołączonego imbusowego klucza z kulistym końcem o rozmiarze 0.05 inch.

Następnie umieść uchwyt strzykawki w uchwycie pipety. Delikatnie wsuń wtryskiwacz pipety do strzykawki wstrzykującej i upewnij się, że końcówka tłoka została wprowadzona bezpośrednio do otworu strzykawki. Po całkowitym wsunięciu przykręć pierścień blokujący uchwytu strzykawki do wtryskiwacza pipety.

Przed wprowadzeniem roztworu próbki białka A a C six prime one eye, należy użyć systemu płukania komórki dostarczonego z instrumentem, aby wypłukać komórkę próbkową co najmniej 50 milliliters buforu płuczącego. Pozostały bufor należy usunąć z komórki próbkowej poprzez aspirację za pomocą szklanej strzykawki 2.5 milliliter z długą igłą. Roztwory z odgazowującego podciśnienia należy usunąć za pomocą drugiej, czystej i suchej długiej igły.

Strzykawka 2,5 ml. Ostrożnie pobierz do strzykawki co najmniej 1,8 ml próbki białka A a C six prime one eye. Należy zachować ostrożność, aby uniknąć pęcherzyków powietrza.

Po napełnieniu strzykawki próbką białka, wprowadź igłę do kuwety z próbką i delikatnie dotknij jej dna. Podnieś igłę o około jeden milimetr i powoli wstrzyknij próbkę do kuwety, aż nad jej górną krawędzią pojawi się nadmiar cieczy. Aby usunąć z kuwety uwięzione pęcherzyki powietrza, podnieś igłę o około jeden centymetr, upewniając się, że w przelewie nadal znajduje się roztwór, a następnie szybko odciągnij i wstrzyknij około 0,25 mililitra roztworu.

Następnie ostrożnie przesuń igłę w górę wzdłuż krawędzi otworu przelewowego. W studience z próbką igła napotka krawędź. Odciągnij cały płyn znajdujący się powyżej tej krawędzi, ponieważ wyznacza ona pożądaną wysokość roztworu prowadzącego.

Aby napełnić strzykawkę do wstrzykiwania, przymocuj plastikową strzykawkę do nadmuchiwania do portu napełniającego i opuść końcówkę tłoka do górnej krawędzi portu. Następnie umieść rurkę do napełniania pipety z roztworem ligandu DGA na dnie uchwytu pipety. Upewnij się, że końcówka strzykawki nie dotyka dna rurki napełniającej i powoli pobieraj roztwór do strzykawki, aż niewielka jego ilość dostanie się do rurki strzykawki ładującej.

Następnie zamknij port napełniający, opuszczając końcówkę tłoka. Wykonuje się to poprzez kliknięcie przycisku zamykania portu napełniającego. Następnie należy usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza, które mogły zostać uwięzione podczas ładowania.

Opróżnij i napełnij układ, klikając przycisk purge refill. Powtórz proces opróżniania i napełniania łącznie trzy razy. Po zakończeniu procesu opróżniania i napełniania wyjmij rurkę napełniającą z uchwytu pipety i delikatnie przetrzyj końcówkę strzykawki papierowym ręcznikiem laboratoryjnym.

Teraz opuść strzykawkę zespołu pipetującego do próbki. Należy zachować ostrożność i postępować powoli, ponieważ igła może łatwo się wygiąć. Upewnij się, że strzykawka została całkowicie włożona, naciskając podstawę pierścienia blokującego.

Po zabezpieczeniu strzykawki ustaw pożądaną temperaturę pracy i wybierz moc odniesienia, która jest nieco większa niż maksymalny oczekiwany przepływ ciepła podczas wtrysku. W tym przykładzie jako temperaturę pracy i moc odniesienia zastosowano odpowiednio 20 °C oraz 20 µcal/s. Następnie zaprogramuj pożądane objętości wtrysku oraz opóźnienia.

W tym przypadku wykonuje się 28 wstrzyknięć, z których pierwsze ma objętość 2 µL i opóźnienie wynoszące 62 jednostki, a kolejne wstrzyknięcia mają objętość 10 µL z opóźnieniami wynoszącymi 332 jednostki. Przedstawiony tutaj eksperyment stanowi podstawę do stworzenia zbioru danych dla pojedynczego stężenia w celu wygenerowania niezbędnych dodatkowych krzywych. Proces ten należy powtórzyć, zmniejszając stężenia makrocząsteczki i ligandu.

Należy upewnić się, że wszystkie próbki makrocząsteczek i ligandów pochodzą z tego samego roztworu gęstego, aby zminimalizować błędy w stężeniach. Przedstawiony tutaj surowy zapis izotermicznej kalorymetrii miareczkowej uzyskano z miareczkowania 3,86 mM ligandu acetylo-koenzymu A do 192 µM mikrocząsteczki A A C six prime one.

Zintegrowane wartości ciepła wykorzystano do wyznaczenia parametrów wiązania za pomocą dopasowania sekwencyjnego dla dwóch miejsc. Wykres ten przedstawia izotermy uzyskane metodą ITC dla różnych stężeń ACE Koenzymu A oraz AAC C six Prime One Eye. Dane eksperymentalne, reprezentowane przez otwarte okręgi, dopasowano zarówno do modelu dwóch niezależnych zestawów miejsc, jak i do modelu sekwencyjnego dla dwóch miejsc.

Lepsza zgodność jest obserwowana w przypadku sekwencyjnego modelu dwumiejscowego. Stężenia białek wykorzystane w badaniu są określone w tekście towarzyszącym. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest zachowanie bardzo wysokiej precyzji przy rozcieńczaniu, ponieważ zmiana stężeń może mieć drastyczny wpływ na uzyskane wyniki.