Genotypowe wnioskowanie o tropizmie HIV-1 z wykorzystaniem sekwencjonowania populacyjnego pętli V3

Ogólnym celem tej procedury jest określenie tropizmu wirusa u pacjenta zakażonego HIV poprzez sekwencjonowanie regionu V3 genu otoczki wirusa. W pierwszej kolejności należy wyekstrahować HIV RNA z osocza krwi pacjenta. Następnie, za pomocą zagnieźdzonej reakcji RT-PCR, należy przeprowadzić amplifikację regionu V3 białka gp120 HIV. Po tym etapie należy potwierdzić obecność produktu za pomocą elektroforezy żelowej, a następnie przeprowadzić sekwencjonowanie populacyjne amplifikowanych produktów regionu V3.

Na koniec przeanalizuj sekwencje za pomocą oprogramowania do odczytu zasad (base calling) i wywnioskuj wykorzystanie koreceptora, stosując algorytm genome-to-pheno. Ostatecznie wyniki te mogą wykazać, czy populacja wirusa u pacjenta jest R5 czy nie-R5, poprzez sekwencjonowanie populacyjne pętli V3 HIV-1. Główną zaletą tej metody analizy tropizmu w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak fenotypowe testy komórkowe, jest możliwość jej przeprowadzenia w każdym laboratorium wyposażonym w aparaturę do sekwencjonowania, przy niższych kosztach, w krótszym czasie i przy użyciu mniejszej ilości materiału wyjściowego.

Technika ta ma znaczenie dla leczenia terapią antyretrowirusową, ponieważ pozwala ustalić, czy populacja wirusowa pacjenta prawdopodobnie zareaguje na antagonistę CCR5 z próbki 500 µL osocza. Do wyekstrahowania HIV RNA należy użyć automatycznego ekstraktora EasyMag. Następnie należy przejść do pomieszczenia PCR typu clean room w celu przygotowania RT-PCR, aby zapewnić odpowiednie próbkowanie populacji wirusowej.

Zaplanuj wykonanie każdej reakcji odwrotnej transkrypcji w trzech powtórzeniach w ramach tej jednokrocznej reakcji. Wykorzystaj wirusowe RNA do syntezy cDNA, specyficznie amplifikując region HIVV three przy użyciu starterów SQV three F1 oraz CO 6 0 2 prime repair. Opieraj się na składnikach na jedną reakcję.

Przygotuj roztwór mieszaniny zapasowej w ilości wystarczającej dla liczby próbek do amplifikacji, korzystając z pipety wielokanałowej. Dodaj 36 µL mieszaniny próbek do każdego dołka płyty PCR. Następnie użyj pipety wielokanałowej, aby przenieść odpowiednią liczbę mikrolitrów ekstraktu RNA z próbek do wyznaczonych dołków. Pamiętaj o zmianie końcówek po każdym dodaniu.

Po zakończeniu przenoszenia należy przykryć dołki nakrętkami do płytek PCR. Następnie płytkę PCR należy umieścić w termocyklerze zaprogramowanym na jednokrokowy R-T-P-C-R regionu trzech HIVV. W przypadku PCR zagnieżdżonego należy użyć zestawu starterów SQV three F two oraz CD four R.

Oblicz ilość odczynnika wymaganą dla liczby próbek do amplifikacji w czystym pomieszczeniu do PCR. Przygotuj mieszaninę do nested PCR, a następnie za pomocą pipety wielokanałowej nanieś 19 µL do każdego dołka czystej płytki PCR. Po zakończeniu procesu R-T-P-C-R przejdź do pomieszczenia poamplifikacyjnego.

Za pomocą ośkanałowej pipety wielokanałowej przenieś 1 µL matrycy R-T-P-C-R do mieszaniny do nested PCR. Zmieniaj końcówki po każdym dodaniu. Przykryj dołki nakrętkami paskowymi do PCR i przenieś płytkę do termocyklera w celu amplifikacji.

Wyjmij płytkę z termocyklera po powrocie temperatury do 25 °C. Aby potwierdzić, że region V3 został pomyślnie amplifikowany, w pierwszej kolejności przeanalizuj produkty za pomocą elektroforezy w żelu. Przygotuj żel agarozowy o stężeniu 1,6% z barwnikiem do żeli CyberSafe.

Używając wielokanałowej pipety o objętości 10 µL, przenieś 8 µL próbek PCR do odpowiednich dołków. Do przynajmniej jednego dołka w każdym rzędzie nanieś również drabinę DNA.

Przeprowadź elektroforezę żelu przy napięciu około 100 V przez 10 minut. Zwizualizuj prążki za pomocą fluorescencji ultrafioletowej i udokumentuj obraz za pomocą fotografii. Odnotuj próbki, w których wszystkie powtórzone trzykrotnie amplifikacje zakończyły się sukcesem.

W razie potrzeby powtórzyć RT-PCR dla tych próbek, w których uzyskano mniej niż trzy amplifikacje produktu. Próbki amplifikowanego cDNA wirusa zostaną następnie zweryfikowane za pomocą reakcji sekwencjonowania DNA z wykorzystaniem starterów V 3 0 2 F oraz S QV three R one. Wyjąć odczynnik big di z zamrażarki i rozmrozić w temperaturze pokojowej.

Obliczyć i przygotować odczynniki wymagane dla liczby próbek przeznaczonych do analizy. Przenieść pięć µL mieszaniny reakcyjnej do sekwencjonowania do odpowiednich dołków płytki, używając pipety wielokanałowej. Przykryć płytkę chusteczką Kim wipe i odstawić.

W międzyczasie przygotuj rozcieńczenie produktu amplifikacji PCR w stosunku 1:15, dodając 180 µL sterylnej wody do pozostałego produktu PCR. Pipetą nanieś 1 µL rozcieńczonej próbki na dno odpowiedniej płytki. Zawsze wymieniaj końcówki między próbkami po zakończeniu przenoszenia każdej z nich.

Zamknij płytkę za pomocą nakrętek paskowych i wymieszaj w vorteksie przez jedną sekundę. Aby odwirować płytkę, ustaw prędkość na 140 5G. Gdy prędkość wirowania osiągnie 140 5G, zatrzymaj wirowanie.

Umieść płytkę w termocyklerze, aby reakcja mogła zajść. W każdej studni wytrąć DNA, dodając 4 µL 3 M octanu sodu oraz 40 µL schłodzonego 95% etanolu, a następnie ponownie zamknij zakrętki. Wstrząśnij płytką w wstrząsarku (vortex) przez 10 sekund i opukaj płytkę, aby usunąć pęcherzyki powietrza.

Umieść płytki w temperaturze -20 °C na czas od 30 minut do dwóch godzin. Odzyskaj DNA poprzez wirowanie przy 2000 ×g przez 20 minut. Zdejmij i wyrzuć nakrętki paskowe.

Odwróć płytkę nad pojemnikiem na odpady i zlej nadsącz. Usuń pozostałości nadsączu, osuszając odwrócone płytki ręcznikiem papierowym.

Złóż dwa arkusze ręcznika papierowego, aby objąć nimi płytkę. Umieść płytkę stroną skierowaną w dół w wirówce i wiruj z prędkością 140 5G. Zatrzymaj wirowanie po osiągnięciu 140 5G.

Następnie przemyć 155 µL 95% etanolu i odlej ciecz. Powtórz odwirowanie. Pozostaw płytkę na dwie do pięciu minut, aby resztki etanolu odparowały.

Aby zdenaturować próbki DNA, należy użyć pipety wielokanałowej i nanieść 10 µL wysokiego barwnika do maide do wszystkich dołków na płytce, w tym do tych pustych. Płytkę należy zamknąć septą i umieścić w termocyklerze w temperaturze 90 °C przez dwie minuty. Na koniec płytkę z próbkami należy włożyć do płytki sekwencyjnej, a następnie do sekwenatora.

Jednym z dopuszczalnych sposobów analizy danych jest wykorzystanie oprogramowania recall do automatycznego odczytu zasad (base calling) bez ingerencji człowieka. Recall jest bezpłatnym, specjalistycznym oprogramowaniem do odczytu zasad; należy zalogować się i wybrać pliki z próbkami do przesłania za pomocą opcji przeglądania (browse). Należy zlokalizować plik z surowymi danymi sekwencjonowania i przesłać do 20 megabajtów danych.

Następnie ustaw sekwencję referencyjną na V three. Kliknij process data. Wybierz wynikowy folder po prawej stronie strony, aby wyświetlić listę próbek.

Te, które są czerwone, nie przeszły pomyślnie weryfikacji. Te, które są zielone, zostały zaakceptowane. Klikając na konkretną próbkę i przycisk wyświetlania, można przejrzeć sekwencję, postępować zgodnie z instrukcjami po prawej stronie strony, aby nawigować po sekwencji oraz pobrać pliki w folderze zip.

Tropizm wirusowy można wywnioskować z sekwencji uzyskanych metodą sekwencjonowania populacyjnego z wykorzystaniem algorytmu korelacji genotyp-fenotyp dla koreceptorów. Z menu rozwijanego w ustawieniach istotności wybierz opcję optymalizacji na podstawie analizy danych klinycznych z badania motivate 2% oraz 5,75% FPR. Następnie wybierz opcję przesłania pliku lub wklejenia sekwencji do analizy.

Pliki FASTA są dopuszczalne. Nie dodawaj innych, aby przejść do uzyskania geno Tono FPRA, predyktora odpowiedzi na antagonistów CCR5. Wygenerowany raport G two P podaje sekwencję pętli V3 w aminokwasach i wskazuje istotne pozycje mutacji związanych z wirusem n R5.

Na dole raportu podano współczynnik wyników fałszywie dodatnich i zinterpretowano go pod kątem odpowiedzi na antagonistę CCR5. Raport ten można pobrać w formacie PDF. Jeśli którakolwiek z trzech sekwencji z próbki zostanie uznana za nie-R5, pacjent prawdopodobnie nie odpowie na antagonistę CCR5 zgodnie z oczekiwaniami; elektroforeza żelowa produktów RTP CR pętli V3 HIV-1 wskazuje, że nie wszystkie próbki kliniczne dają produkt.

Wygenerowane sekwencje z amplifikowanych próbek można zwizualizować na chromatogramie odczytanym przez program recall. Oczekuje się uzyskania czystej sekwencji z niewielką liczbą mieszanin. Sporadycznie sekwencje mogą być nieczytelne i nie pozwalać na dokładne przypisanie zasad.

Niektóre pacjentów można zidentyfikować jako posiadających wirusa niekorzystającego z CCR5, tak jak pokazano tutaj. Pacjenci ci prawdopodobnie nie zareagują na leczenie antagonistą CCR5. Jednak u większości pacjentów stwierdza się populację wirusową składającą się z wirusa korzystającego z CCR5, co jest wskazane zieloną ramką na dole raportu z analizy G2P.

Po opanowaniu tej techniki, cały proces od początku do końca – od ekstrakcji po analizę – można przeprowadzić w ciągu około czterech dni. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat przewidywania tropizmu wirusowego przy użyciu metod sekwencjonowania populacyjnego w połączeniu z algorytmem bioinformatycznym genome pheno.

To już wszystko. Dziękujemy za obejrzenie filmu i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.