Izolacja wysepek trzustkowych myszy

Witam, nazywam się Greg Zott. Pracuję w Laboratorium Bluestone w Centrum Cukrzycy UCSF i dzisiaj zaprezentuję proces izolacji wysepek trzustkowych myszy. Procedura obejmuje wstrzyknięcie roztworu kolagenazy do trzustki myszy dawcy szczepu C3 H, a następnie usunięcie trzustki, jej trawienie, oczyszczenie wysepek na gradiencie w probówce oraz ich ręczny dobór w celu końcowego przeszczepienia do torebki nerki cukrzycowej myszy NOD, która będzie naszym biorcą.

Przed rozpoczęciem tej procedury rozcieńczyliśmy roztwór ATE w zmodyfikowanym buforze Hanksa i dostosowaliśmy stężenie specjalnie do linii myszy C3 H, której używamy. Ustaliliśmy, że trawienie przebiega lepiej przy zastosowaniu roztworu kolagenazy o stężeniu 0,8 mg/mL, którego użyjemy do wstrzyknięcia do wspólnego przewodu żółciowego w celu rozszerzenia trzustki. Procedurę przeprowadzi dziś Pavo Codre z centrum diabetologii. Wykona on nacięcie, otworzy mysz, odsłoni jelita, a następnie wstrzyknie preparat do wspólnego przewodu żółciowego.

Myszy spryskamy etanolem, aby wygładzić futro, a następnie za pomocą uciśnięcia palca u nogi zweryfikujemy, czy zwierzę zostało prawidłowo uśmiercone. Pavo otworzy teraz jamę brzuszną myszy, wykonując cięcie w linii środkowej, aby odsłonić jelita i trzustkę. Przetniemy również przeponę, aby potwierdzić uśmiercenie myszy.

Zanim zaczniemy, chciałbym wskazać niektóre z ważnych struktur. Żołądek znajduje się tutaj, a pod nim przylega trzustka, łącząca się z dwunastnicą powyżej. To jest wątroba, w której znajdziemy pęcherzyk żółciowy oraz wspólny przewód żółciowy, który możecie zobaczyć tutaj.

W następnym kroku Pavo wyizoluje jelito cienkie i zlokalizuje miejsce wpadania wspólnego przewodu żółciowego do jelita cienkiego. Po odsłonięciu jelita, zaciskamy obie strony wspólnego przewodu żółciowego za pomocą kleszczyków typu mosquito. Stwierdzamy, że pozwala to na przedostanie się większej liczby kolagenatów do trzustki, podczas gdy inne grupy starają się umieścić zacisk bezpośrednio nad wspólnym przewodem żółciowym.

Ustaliliśmy, że technika ta lepiej umożliwia wprowadzenie enzymu do trzustki. Jest to procedura delikatna. Należy unikać przerwania ciągłości jelita.

Zaciski powinny spoczywać delikatnie po obu stronach wspólnego przewodu żółciowego. Teraz zlokalizujemy pęcherzyk żółciowy, a po jego odsłonięciu posłuży on jako punkt orientacyjny do wstrzyknięcia kolagenazy do wspólnego przewodu żółciowego. Powell używa igły o rozmiarze 30 G oraz strzykawki o pojemności 5 cc zawierającej 3 ml roztworu kolagenazy.

Wprowadzając go do przewodu żółciowego wspólnego, rozszerza on ten przewód roztworem kolagenazy, a następnie przesuwa się w dół przewodu żółciowego wspólnego, aż dotrze w okolice jelita. Podczas przesuwania się w dół, roztwory enzymów są pompowane i wstrzykiwane do trzustki. Po wypełnieniu trzustki roztworem kolagenazy, Powell usunie zaciski hemostatyczne, a następnie ostrożnie wyjmie trzustkę z organizmu myszy, oddzielając ją od jelita.

Usuwa go z żołądka. Dobrze, a następnie używając śledziony jako uchwytu, unosi trzustkę i powoli odcina ją w obrębie wspólnego przewodu żółciowego i to wszystko. Trzustka zostaje wypreparowana, a następnie usuwa się śledzionę; tutaj usuwa on tkankę krezkową, po czym trzustka zostaje umieszczona w sterylnej szklanej fiolce z roztworem kolagenazy 2 mg/mL i ponownie umieszczona w lodzie.

Wyizolowaną trzustkę umieszczoną w szklanych fiolkach należy teraz włożyć do kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C na około 17 minut. Fiolki umieściliśmy w statywie z probówkami stożkowymi o pojemności 50 ml, aby nie wypłynęły na powierzchnię. Od momentu umieszczenia w kąpieli uruchamiany jest stoper i rozpoczyna się proces trawienia.

Po zakończeniu czasu trawienia fiolki zostają wyjęte, a następnie delikatnie wstrząśnięte i rozbite. Gdy tkanka zaczyna się rozpadać, fiolkę umieszcza się w lodzie. Na zlewce o pojemności 400 ml zawierającej bufor płukający nakłada się sterylne sito.

Następnie zawiesinę z trawienia trzustki ostrożnie przelewa się przez sito do buforu płuczącego. Na potrzeby demonstracji wyciąg został wyłączony, a szybę wyciągu podniesiono, aby umożliwić obserwację czynności. Po przelaniu zawiesiny z trawienia trzustki do zlewki, probówki płucze się tym samym buforem płuczącym, a następnie bufor ten przelewa się przez sito.

Mamy strzykawkę wypełnioną buforem piorącym. Użyjemy jej do wymuszonego przemycia tkanki przez sito. Celem jest usunięcie wszelkich luźnych oczek, które nie są przytwierdzone do macierzy, przy jednoczesnym pozostawieniu błon i niestrawionej tkanki na sicie.

Po zakończeniu płukania tkanki, na koniec procedury zazwyczaj widoczny jest taki obraz. Tkanka trzustki znajdująca się na dnie probówki zostanie teraz przeniesiona do dwóch stożkowych probówek o pojemności 50 ml, gdzie tkanka zostanie wypłukana, równomiernie wymieszana, a następnie rozdzielona tak, aby w każdej probówce uzyskać taką samą objętość osadu. Zlewkę należy teraz przepłukać dodatkową porcją buforu do płukania.

Ścianki należy wypłukać, aby przenieść całą tkankę z powrotem do zlewki. Następnie zawartość rozdziela się po równo między dwie probówki, po 50 ml do każdej. Następnie probówki stożkowe dopełnia się buforem płuczącym.

Tkankę kilkakrotnie odwraca się, a następnie umieszcza w wirówce. Jest to wirowanie krótkotrwałe. Pozostawia się wirówkę do osiągnięcia prędkości 1000 RPM, a następnie wyłącza urządzenie.

Tkanka w tym momencie jest bardzo wrażliwa, dlatego należy unikać jej nadmiernego zagęszczania. Probówki zostają wyjęte i krok płukania zostanie powtórzony jeszcze trzy razy. To koniec trzeciego płukania.

Zawartość probówki stożkowej 50 ml przenosi się do probówki stożkowej 15 ml, a następnie wiruje z prędkością 1000 RPM do momentu zatrzymania. Następnie usuwa się nadsącz i rozpoczyna pierwszą część protokołu FI Call. Znajdujemy się na etapie, w którym otrzymaliśmy osad z trawienia trzustki.

Resuspendujemy tę tkankę, aby była dobrze oddzielona od pelletów. Następnie dodamy pierwszy gradient gęstości o wartości 1 1 0 8. Do każdej probówki dodamy 5 ml.

Następnie osad należy dokładnie wymieszać w każdym z gradientów. Ważne jest, aby uzyskać dobrą dystrybucję tkanki w najcięższym gradiencie. Teraz nałożymy 2 ml roztworu o gęstości 1 0 9 6.

Następnie nałożymy warstwę 2 mil gęstości 1 0 6 9, a ponad nią warstwę gęstości 1 0 3 7. Ważne jest, aby podczas nakładania warstw gęstości nie dopuścić do ich wymieszania. W ten sposób wszystkie warstwy zostały dodane do probówki.

Widać tutaj górne warstwy frakcji 1 1 0 8, 9 1 0 9 6, 1 0 6 9 oraz 1 0 3 7. Można zauważyć, że tkanka zaczyna już przemieszczać się do poziomu swojej właściwej gęstości, nawet bez wirowania w wirówce. Gradienty w probówkach są rozpędzane do prędkości 1800 RPM przez 15 minut; należy pamiętać, aby wyłączyć hamulec po wyjęciu probówek z wirówki.

Można zauważyć, że pomiędzy warstwą 0 0 9 6 a 0 0 7 znajduje się wyraźny pas tkanki wysepek trzustkowych. Teraz należy usunąć warstwę 0 3 7, aby pozbyć się wszelkich resztek tkankowych i DNA, które mogły zostać uwolnione podczas procesowania. Używając sterylnej plastikowej pipety Pasteura, Pablo usunie teraz warstwę wysepek i przeniesie je do probówki stożkowej 50 ml zawierającej 25 ml buforu płukającego.

Należy wykonać ten krok szybko, ponieważ fol jest toksyczny dla eyeletów. W rzeczywistości usunęliśmy całą warstwę 0 6 9 oraz 0 9 6. Pavo odcina górną część plastikowej pipety pastoralnej i płucze ją buforem piorącym.

Następnie oczka poddaje się wirowaniu w taki sam sposób, jak poprzednio. Wirówkę rozpędza się do 1000 RPM, po czym zatrzymuje i aspiruje nadsącz. Oczka przemywa się trzykrotnie w medium do przemywania.

Właśnie zakończyliśmy proces izolacji wysepek. Przeprowadziliśmy go od etapu trawienia, przez gradient gęstości, aż do otrzymania oczyszczonych wysepek. Po trzecim przemyciu buforem do mycia, zawiesiliśmy wysepki w medium RPMI i przenieśliśmy je na płytkę do hodowli tkankowych. Wysepki te są teraz gotowe do testów in vitro lub przygotowań in vivo, takich jak transplantacja wysepek.