Rekonstrukcja kompleksu egzosomu metodą kriotomografii elektronowej pojedynczych cząsteczek z wykorzystaniem metody losowych przechyłów stożkowych

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest uzyskanie trójwymiarowej struktury kompleksu egzosomu przy użyciu metody losowego nachylenia stożkowego. Osiąga się to najpierw poprzez naniesienie cienkiej warstwy filmu węglowego na perforowaną siatkę węglową, aby stworzyć podłoże dla kompleksu białkowego, a w drugim kroku poprzez zastosowanie barwnika. Próbka oraz barwnik są nanoszone na siatkę, co powoduje zanurzenie próbki w solach metali ciężkich.

Następnie wykonuje się mikroskopię elektronową w celu uzyskania par mikrografii preparatu pod różnymi kątami nachylenia. W końcowej fazie, na podstawie analizy obrazów z zastosowaniem metody losowego nachylenia stożkowego (random conical tilt), otrzymuje się wyniki obrazujące trójwymiarową strukturę kompleksu egzosomów. Zazwyczaj osoby początkujące w tej metodzie napotykają trudności, ponieważ zarówno prawidłowe przygotowanie preparatu do metody losowego nachylenia stożkowego, jak i następująca po nim procedura przetwarzania obrazów bywają wymagające.

Prezentacja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy gradacji i przygotowania preparatu są trudne do opanowania bez ilustracji procesu oceny próbek. Zasada metody losowego pochylenia stożkowego (random conical tilt) wymaga wykonania pary mikrografii tego samego obszaru preparatu w mikroskopie elektronowym. Pierwsze zdjęcie wykonuje się w pozycji niepochylonej, a drugie przy pochyleniu preparatu pod kątem od 50 do 70 stopni. Za pomocą komputera zdigitalizowana para mikrografii jest zestawiana obok siebie, a w niniejszej ilustracji zaznaczono obrazy tych samych cząsteczek.

Obrazy te są oznaczone numerami w współrzędnych trójwymiarowych. Obrazy cząsteczek niepochylonych oraz ich odpowiedników pochylonych są ze sobą skorelowane poprzez kierunek osi pochylenia oraz kąt pochylenia. Wyrównanie obrazów cząsteczek niepochylonych przenosi obrazy cząsteczek pochylonych do ich odpowiadających lokalizacji asMule; wykorzystując wiele obrazów cząsteczek pochylonych wypełniających przestrzeń azymutalną, można zrekonstruować trójwymiarową strukturę cząsteczki za pomocą algorytmu wstecznej projekcji. Aby przygotować siatki, najpierw sporządzić 0,5% roztwór formVAR, dodając 0,45 g żywicy poliwinyloformalnej oraz 90 ml chloroformu do 100 ml szklanego zlewki.

W dygestorium przykryć zlewkę folią aluminiową i rozpuścić żywicę formvar. Przy użyciu małego magnesu i mieszadła magnetycznego rozpuszczanie żywicy trwa około 15 minut. W tym czasie oczyścić uprzednio wyczyszczone szkiełka przedmiotowe do mikroskopii w metanolu, używając chusteczek Kim wipes.

Po całkowitym rozpuszczeniu żywicy formvar w chloroformie, nanieść jeden mililitr 50% glicerolu na powierzchnię roztworu. Regulacja objętości dodanego glicerolu wpływa na gęstość otworów w porowatym węglu.

Zanurz końcówkę sonikatora w roztworze. Na głębokości około jednej cala zastosuj maksymalną moc, aby sonykować próbkę przez jedną minutę, co doprowadzi do powstania emulsji kropli glicerolu w naszym roztworze. Dłuższa sonikacja spowoduje powstanie mniejszych otworów w dziurawym węglu.

Po tym kroku roztwór staje się mętny. Natychmiast po kąpieli sonicznej zanurz czyste szkiełka przedmiotowe pionowo w emulsji. Po jednej sekundzie wyjmij je i osusz dół szkiełek za pomocą papieru filtracyjnego, aby na ich powierzchni utworzył się cienki film plastyczny.

Po odparowaniu chloroformu należy sprawdzić gęstość i rozmiar otworów w błonie pod mikroskopem świetlnym. Opisane tutaj warunki przygotowania powinny zapewnić powstanie od 10 do 20 otworów w każdym kwadracie siatki o oczku 400 mesh, o średnicach od trzech do czterech mikrometrów. Po wyschnięciu szkiełek przedmiotowych należy odciąć krawędź plastikowej błony na powierzchni szkiełka.

Unieś błonę na powierzchnię wody destylowanej, zanurzając szkiełko w wodzie ruchem pionowym. Cienką błonę na powierzchni wody można zaobserwować pod ostrym kątem w świetle odbitym. Na błonie umieść po kolei miedziane siatki o gęstości 400 mesh, gładką stroną siatki skierowaną w dół.

Podnieść plastikową folię z siatką, używając kawałka papieru. Odwrócić papier i pozostawić go do wyschnięcia. W szalce Petriego zanurzyć papier w metanolu, aby usunąć pozostałości glicerolu z otworów, a następnie pozostawić papier do wyschnięcia na powietrzu.

Użyj parownika węglowego, aby pokryć siatki warstwą węgla o grubości około 20 nanometrów. Pożądaną grubość kontroluj za pomocą czasu parowania. Grubość można określić na podstawie szarego koloru węgla w porównaniu z szarym kolorem warstwy węgla o znanej grubości.

Namocz siatki z warstwą węglową w chloroformie w szklanej płytce Petriego przez pół godziny, aby usunąć formvar; późniejsze wysuszenie siatek pozwala na otrzymanie domowej roboty ażurowych siatek węglowych. Następnie naparuj cienką warstwę węgla o grubości około 5 nm na świeżo rozszczepioną powierzchnię miki. Potem ostrożnie umieść ażurowe siatki węglowe na kawałku papieru filtracyjnego pod wodą destylowaną.

W urządzeniu wykonanym samodzielnie, wypłyń cienką warstwą węgla z powierzchni miki na powierzchnię wody, a następnie powoli osadź ją na siatkach węglowych. Podnieś papier filtracyjny z znajdującymi się na nim siatkami i pozostaw do wyschnięcia. W dygestorium rozpocznij negatywne barwienie kompleksu egzosomów, przygotowując świeży 2% roztwór mręczanu uranylu.

Zgodnie z opisaną procedurą, należy przykryć probówkę z roztworem kawałkiem folii aluminiowej. Aby zapobiec ekspozycji na światło, roztwór musi być zużyty tego samego dnia. Poddaj siateczkę węglową działaniu wyładowań żarowych w aparacie do wyładowań żarowych. Następnie połóż kawałek czystego Parafilmu na blacie, nanieś pipetą trzy krople po 50 µL roztworu barwiącego do mrowianu mocznika na wierzch Parafilmu, rozcieńcz kompleks egzosomów do stężenia około 50 nM przy użyciu buforu do rozcieńczania i nanieś pipetą 4 µL rozcieńczonego białka na siateczkę poddaną wyładowaniom żarowym.

Pozostaw próbkę na siatce przez jedną minutę, a następnie za pomocą pęsety odsącz pozostały roztwór kawałkiem papieru filtracyjnego. Natychmiast odwróć siatkę na pierwszą kroplę barwnika i wypłucz ją, przesuwając siatkę kilkakrotnie w przód i w tył przez około 10 sekund. Powtórz ten proces dla każdej z trzech kropli barwnika; po ostatnim płukaniu pozostaw barwnik na siatce przez dodatkową jedną minutę.

Następnie odsącz nadmiar barwnika za pomocą kawałka papieru filtracyjnego. Pozostaw cienką warstwę roztworu barwiącego na powierzchni siateczki i pozwól jej wyschnąć w dygestorium. Umieść siateczkę z próbką w uchwycie, a następnie włóż uchwyt do mikroskopu elektronowego FEI TE nine 12.

Sprawdź siatkę próbek przy niskim powiększeniu, aby znaleźć najlepiej zabarwione kwadraty. Dobrze zabarwiony kwadrat powinien posiadać kilkanaście otworów o wymiarach około jeden do dwóch mikrometrów z ciemnymi, zabarwionymi obszarami w ich wnętrzu. Włącz tryb niskiej dawki (low dose mode) w interfejsie użytkownika FEI, a następnie ustaw ostrość wyszukiwania i pozycję ekspozycji w tym trybie.

Ustaw wyszukiwanie w trybie frakcyjnym przy długości kamery 1,5 meter. Ustaw ostrość na powiększenie 150 K, a naświetlanie na powiększenie 50 K z czasem ekspozycji wynoszącym jedną sekundę. Zazwyczaj do wykonania wyrównania wykorzystuje się rozpoznawalny element na siatce, widoczny zarówno w trybie wyszukiwania, jak i naświetlania.

W trybie wyszukiwania zlokalizuj otwory z dobrym barwieniem i zapisz ich położenie. Wykonaj zdjęcie kwadratu za pomocą kamery CCD. Przechyl próbkę pod kątem 55 stopni i wykonaj kolejne zdjęcie.

Porównaj oba zdjęcia i zidentyfikuj odpowiadające sobie otwory na obu mikrografiach. Przechyl stolik z powrotem do zera stopni. Używając zestawu do niskiej dawki, wykonaj zdjęcia każdego otworu zidentyfikowanego w trybie wyszukiwania przy dużym powiększeniu i defokusie wynoszącym około -0,7 µm.

Po wykonaniu zdjęć wszystkich otworów należy przechylić stół pod kątem 55 stopni przy zachowaniu tego samego powiększenia. Należy wykonać mikrofotografie przechylonej próbki z defocusowaniem wynoszącym około -1,2 micrometers. Odpowiednią parę mikrofotografii pod kątem należy zidentyfikować na podstawie wzorów widocznych na mikrofotografiach przy małym powiększeniu, wykorzystując nieregularny wzór własnej roboty ażurowych siatek węglowych.

Aby pomóc w korelacji, należy wybrać pary mikrografii pod różnymi kątami nachylenia, które charakteryzują się równomiernym rozkładem cząsteczek i brakiem halo wokół nich. Mikrografie z wyraźnym halo barwnika powinny zostać odrzucone podczas przetwarzania danych. Rozpocznij od konfiguracji programu w procedurze.

Przetwarzanie obrazów zostanie zademonstrowane z wykorzystaniem procesu 2D w pakiecie Eman. Aby zmienić format obrazu, należy użyć pakietu iMagic five do dopasowania 2D oraz pakietu spider. W celu przeprowadzenia rekonstrukcji 3D i optymalizacji, należy przekonwertować cyfrowy obraz Gatan DM three do formatu obrazu spider.

Używając polecenia process 2D, wybierz pary cząstek. Dzięki programowi internetowemu dołączonemu do pakietu programów spider, program automatycznie zapisuje współrzędne cząstek i wycina wszystkie wybrane cząstki przy użyciu skryptu spider. Skrypt zapisuje stosy cząstek nachylone oraz nienachylone.

Konwertuj niepochylone cząstki UN do formatu IMAG five. Używając programu EM two EM, wykonaj filtrację pasmową oraz maskowanie niepochylonych cząstek UN za pomocą polecenia InCorp prep w programie IMAG five, a następnie wycentruj cząstki z nałożoną maską pasmową, korzystając z polecenia center. W programie IMAG five wyrównaj i klasyfikuj cząstki iteracyjnie do klas jednorodnych, wykorzystując skrypt wsadowy do automatycznego uruchamiania programów IMAG five.

Następnie należy użyć polecenia MSA names in class w programie IMAG five, aby wygenerować tabelę wyszukiwania klas cząsteczek, a następnie za pomocą polecenia header wygenerować plik wykresu wartości translacji i rotacji dopasowania dla każdej cząsteczki. W programie iMagic five należy przekonwertować dopasowane cząsteczki do formatu spider przy użyciu programu EM two EM. Następnie należy przekształcić tabelę wyszukiwania klas w pliki dokumentacji spider.

Wartości translacji i rotacji dopasowania dla każdej cząsteczki są również konwertowane do pliku dokumentu spider; zastosuj filtr pasmowy, maskę i wycentruj przechylone cząsteczki w taki sam sposób, jak w przypadku cząsteczek nieprzechylonych w programie IMAG five, a następnie wygeneruj nowy zestaw danych dla wycentrowanych cząsteczek przechylonych. Utwórz pliki dokumentów kątowych na podstawie dokumentów dopasowania wieloreferencyjnego wygenerowanych przez IMAG five oraz plików DCB wygenerowanych przez program internetowy. Użyj skryptu projekcji wstecznej w programie spider, aby uzyskać jeden model początkowy dla każdej średniej klasy.

Na koniec, przy użyciu skryptu spider, przeprowadź udoskonalenie projekcji wstępnego wolumenu dla wszystkich cząstek niepochylonych, aby uzyskać końcowy wolumen za pomocą RCT. Uzyskano około 50 rekonstrukcji egzosomu. Wolumeny zostały wygenerowane z cząstek pochylonych odpowiadających każdej cząstce w 50 klasach cząstek niepochylonych.

Wykorzystując wsteczną projekcję zaimplementowaną w pakiecie spider, przeprowadzono doprecyzowanie dopasowania projekcji. Używając tych wolumenów jako modeli początkowych, wygenerowano wyświetlony trójwymiarowy wolumen egzosomu o rozdzielczości około 18 Å; następnie w mapie 3D można umieścić modele atomowe różnych części kompleksu. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobre zrozumienie sposobu wykorzystania RCT do uzyskiwania rekonstrukcji trójwymiarowych – od przygotowania odpowiedniej orientacji siatki preparatu i wykonania mikrografii, aż po uzyskanie rekonstrukcji przy użyciu technik analizy obrazu. Poza opisanym tutaj protokołem istnieje kilka innych metod uzyskiwania końcowych rekonstrukcji w analizie obrazu.

Kluczowym krokiem w celu uzyskania wiarygodnej i poprawnej rekonstrukcji jest praca z odpowiednio przygotowanym preparatem.