Frezowanie wiązką jonową (FIB) i skaningowa mikroskopia elektronowa tkanki mózgowej

Celem niniejszej procedury jest wykonanie serii obrazów konkretnego obszaru tkanki mózgowej przy użyciu skupionej wiązki jonów oraz skaningowego mikroskopu elektronowego. Osiąga się to poprzez wstępne pocięcie mózgu na plastry, które są następnie barwione i zatapiane w żywicy. W drugim kroku obszar zainteresowania zostaje wycięty z zatopionego przekroju mózgu i zamocowany na pustym bloku żywicznym.

Trzecim krokiem jest przycięcie bloku żywicznego za pomocą ultramikrotomu oraz wykorzystanie wiązki jonowej mikroskopu do wyizolowania wyłącznie obszaru przeznaczonego do obrazowania. Ostatnim etapem jest seryjne obrazowanie powierzchni bloku żywicznego przy użyciu wiązki jonowej do wielokrotnego usuwania cienkich warstw przed wykonaniem każdego obrazu. W rezultacie można uzyskać serie obrazów przedstawiających obszar zainteresowania.

Seria obrazów jest gromadzona automatycznie, a zbiór danych zazwyczaj posiada izotropowe woksle, co umożliwia oglądanie struktur obrazowych pod dowolnym kątem w stosie. Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod, takich jak transmisyjna mikroskopia elektronowa sekcji seryjnych, jest możliwość uzyskania znacznie wyższej rozdzielczości w osi Z. W porównaniu natomiast do tomografii elektronowej, pozwala ona na obrazowanie znacznie większych objętości przy optymalnej rozdzielczości dla próbek zatopionych w żywicy.

Procedurę rozpoczyna się od wyjęcia utrwalonego mózgu z znieczuplonego i perfundowanego szczura. Mózg należy zatopić w ciepłym 5% aeros w plastikowej formie, ustawiając go pod odpowiednim kątem przed zastygnięciem aerosu. Następnie blok aeros z mózgiem wewnątrz montuje się w uchwycie do próbek za pomocą wibratomu. Wycina się koronalne skrawki o grubości 80 micron, przygotowując tyle sekcji, ile jest koniecznych do objęcia obszaru zainteresowania.

Następnie umieść próbki w 20 mililitrowych szklanych fiolkach izolacyjnych. Umieść do 10 przekrojów w jednej fiolce. Przepłucz próbki trzykrotnie po pięć minut każdorazowo w 0,1 molarnym buforze K coate.

Następnie próbki barwi się 1,5% cyjankiem potasu i 1% czwórtotlenkiem osmu w 0,1 M buforze K coate przez 30 minut. Kontynuuje się barwienie próbek 1% czwórtotlenkiem osmu w 0,1 M buforze K coate przez 30 minut. Po tym czasie próbki płucze się raz wodą dwukrotnie destylowaną przez trzy minuty, a następnie barwi 1% octanem aluminium w wodzie dwukrotnie destylowanej przez 30 minut.

Następnie płucz skrawki przez pięć minut w wodzie dwukrotnie destylowanej, a potem odwadniaj je w szeregu alkoholi o rosnącym stężeniu, poświęcając dwie minuty na każdą zmianę. Kolejnym krokiem jest zatopienie skrawków w rosnących stężeniach żywicy Duran zmieszanej z alkoholem, zachowując 30 minut odstępu między zmianami. Rozpocznij od proporcji 50 do 50 etanolu do żywicy, następnie 30 do 70, potem 10 do 90, a na koniec pozostaw skrawki w 100% żywicy przez 30 minut.

Następnie zastąp medium 100% świeżą żywicą Duran. Mieszaj powoli przez jedną godzinę na mieszalniku rolkowym. Po zatopieniu, za pomocą drewnianego wykałaczki, umieść przekroje na szklanych przedmiotach do mikroskopu, które zostały wcześniej pokryte środkami oddzielającymi od formy.

Umieść na szkiełkach tak wiele sekcji, jak to możliwe, dbając jednocześnie o to, aby nie były one zbyt gęsto rozmieszczone. Upewnij się, że między szkiełkami mikroskopowymi umieszczono etykiety identyfikacyjne. Umieść szkiełka w inkubatorze w temperaturze 65 °C na 24 godziny.

Następnego dnia wyjmij próbki z pieca. Ostrożnie wsuń żyletkę między szkiełka przedmiotowe i, trzymając warstwę żywicy palcami, wyjmij ją wraz z próbkami spomiędzy szkiełek. Delikatnie opłucz próbkę pod bieżącą wodą.

Aby usunąć pozostałości środków rozdzielających formę, umieść próbkę pod stereomikroskopem z oświetleniem przechodzącym, korzystając z obiektywu o małym powiększeniu. Zaznacz obszar zainteresowania za pomocą cienkiej igły. Użyj żyletki, aby wyciąć niewielki kwadrat o wymiarach 3 mm na 3 mm wokół obszaru zainteresowania.

Użyj kleju akrylowego, aby przymocować mały blok żywiczny do góry pustego bloku żywicznego. Następnie zamocuj blok w uchwycie ultramikrotomu. Patrząc przez podłączony stereomikroskop, przycinaj obszar wokół regionu zainteresowania za pomocą żyletki, aż pozostanie jedynie mała piramida materiału.

Odetnij krawędź bloczka w pobliżu obszaru zainteresowania, prowadząc cięcie pod kątem do górnej powierzchni bloczka za pomocą noża szklanego zamocowanego w ultramikrotomie. Dalszo przytnij bloczek tak, aby obszar zainteresowania można było precyzyjnie zlokalizować względem wymiarów powierzchni bloczka. Wyjmij bloczek z ultramikrotomu i umieść go pod mikroskopem świetlnym w prześwietleniu.

Wykonaj zdjęcie obszaru zainteresowania. Za pomocą piłki jubilerskiej odetnij przyciętą kostkę od pozostałego kikuta żywicy z farbą węglową. Przytwierdź oddzieloną kostkę SA do uchwytu próbek SEM i zorientuj ją tak, aby strona przeznaczona do obrazowania była skierowana w stronę zewnętrznej krawędzi.

Po wyschnięciu kleju przenieś preparat do systemu napylania próżniowego i pokryj bloczek cienką warstwą złota o grubości powyżej 20 nanometrów. Bloczek tkankowy zatopiony w żywicy jest teraz gotowy do obrazowania w skaningowym mikroskopie elektronowym z wiązką zogniskowanych jonów. Wprowadź próbkę wraz z uchwytem do mikroskopu przy niskim powiększeniu i korzystając z obrazowania elektronów wtórnych, zorientuj bloczek tak, aby obszar zainteresowania oraz strona bloczka przeznaczona do obrazowania były skierowane w stronę detektora.

Operator orientuje blok w taki sposób, aby powierzchnia przeznaczona do obrazowania znajdowała się równolegle do wiązki trawiącej. Dzięki temu wiązka elektronów jest skierowana pod kątem 54 stopni do tej powierzchni, przy zastosowaniu prądu wiązki jonowej od 13 do 27 nA i napięciu 30 kV.

Usuń wąski pas żywicy z przedniej części obszaru przeznaczonego do obrazowania. Następnie przełącz na tryb obrazowania elektronów wstecznie rozproszonych, aby obejrzeć sfrezowaną powierzchnię nadległą względem obszaru zainteresowania. Korzystając z wcześniej wykonanego referencyjnego obrazu z mikroskopii świetlnej oraz obrazu sfrezowanej powierzchni, zlokalizuj dokładny obszar na bloku, który ma zostać sfrezowany i obrazowany, używając systemu wtrysku gazu w mikroskopie.

Nanieś ochronną warstwę węgla lub metalu o grubości około jednego mikrona na powierzchnię bloku powyżej obszaru zainteresowania, stosując prąd 700 picoamps. Na koniec wytraw wiązką obszar bloku, w którym zostaną wykonane końcowe obrazy. Pozostaw wiązkę trawiącą do całkowitego wytrawienia tej powierzchni obrazowania, aż na jej powierzchni nie będą widoczne żadne artefakty trawienia.

Wybierz parametry mikroskopu do obrazowania seryjnego powierzchni próbki. Typowe parametry to napięcia od 1,2 do 2 kV oraz rozmiary pikseli od 4 do 20 nm. Czas przebywania wiązki na pikselu powinien wynosić około 10 µs, aby całkowity czas obróbki powierzchni i pozyskania jednego obrazu nie przekraczał dwóch minut.

Pozostaw mikroskop na co najmniej dwie godziny w celu ustabilizowania zmian termicznych. Następnie rozpocznij proces frezowania i obrazowania w celu uzyskania obrazów seryjnych z obszaru zainteresowania. Na tej rycinie przedstawiono obraz elektronów wstecznie rozproszonych w odwróconym kontraście, ukazujący ultrastrukturę w obrębie regionu mózgu.

Widoczne są wszystkie błony, jak również duże struktury makromolekularne. Rycina ta składa się z łącznie 1 600 obrazów zebranych z odstępem pięciu nanometrów, co daje stos obrazów z izotropowymi wokselami. Stos ten można obrazować w dowolnej płaszczyźnie z tą samą rozdzielczością.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak przygotować tkankę mózgu do obrazowania seryjnego z wykorzystaniem skupionej wiązki skaningowego mikroskopu elektronowego.