Wykrywanie modyfikacji potranslacyjnych w natywnych, nienaruszonych nukleosomach metodą ELISA

Ogólnym celem niniejszej procedury jest dokładne określenie względnych poziomów modyfikacji potranslacyjnych w preparatach całkowitych nukleosomów komórkowych otrzymanych z miliona komórek. Osiąga się to najpierw poprzez przygotowanie wysokiej jakości jednorodnych kultur komórek ssaków. Następnie jądra są izolowane z komórek poprzez rozbicie mechaniczne za pomocą homogenizatora Dounce'a i wirowanie.

Kolejnym krokiem jest uzyskanie nienaruszonych nukleosomów poprzez trawienie chromatyny obecnej w jądrach oraz przeprowadzenie serii ekstrakcji w roztworze hipotonicznym. Na koniec nukleosomy poddaje się analizie przy użyciu testu ELISA z odpowiednimi kontrolami w celu zidentyfikowania specyficznych modyfikacji potranslacyjnych. W efekcie można uzyskać wyniki wykazujące względne poziomy konkretnych modyfikacji występujących w próbkach nukleosomów.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak western blotting i immunoprecypitacja chromatyny, jest możliwość łatwego uzyskania globalnego obrazu wielu stanów modyfikacji nukleosomów. Metoda ta jest znacznie bardziej czuła i dokładna niż western blotting i może być wykonywana w większości laboratoriów wyposażonych do ogólnych eksperymentów z zakresu biologii molekularnej. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny komórek macierzystych i epigenetyki, na przykład dotyczące tego, co dzieje się podczas głównych zdarzeń różnicowania i przeprogramowania.

Aby rozpocząć procedurę, najpierw poddaj komórki trypsynizacji, stosując 3 ml trypsyny na płytkę 15 cm, aby uzyskać świeżo zdetacherowane komórki. Dodaj 20 ml lodowatego PBS z maślanem. Przenieś komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i odwiruj w celu zebrania komórek przy 1000 RPM przez 5 minut, odessaj nadsącz i dodaj 10 ml lodowatego PBS z maślanem w celu przemycia, a następnie ponownie odwiruj zawiesinę komórkową przy 1000 RPM przez 5 minut.

Usunąć supernatant i resuspender pellet komórkowy w czterech mililitrach buforu do lizy z inhibitorami proteaz, zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Następnie przenieść komórki pipetą do homogenizatora z tłokiem typu B i przeprowadzić homogenizację na lodzie, wykonując 20 pociągnięć. Następnie przenieść homogenat do probówki wirówkowej na lód.

Wiruj próbkę przy 2000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usuń nadfiltr zawierający materiał cytoplazmatyczny i zawiesinę.

Osad zawiesić w 2 ml lodowatego buforu piorącego C z inhibitorami proteaz, a następnie ostrożnie nałożyć zawiesinę na poduszkę z 30% sacharozy o objętości 5 ml w zimnej probówce do wirówki. W celu izolacji jąder komórkowych odwirować przy 2 400 G przez 5 minut w rotorze z ruchomymi koszyczkami; jądra komórkowe przemieszczą się przez poduszkę, a szczątki komórkowe pozostaną na granicy faz. Po wirowaniu ostrożnie usunąć całą objętość cieczy i ponownie zawiesić jądra w 250 µL lodowatego buforu piorącego C z inhibitorami proteaz, a następnie przenieść jądra do probówki do mikrowirówki o objętości 1,5 ml.

Aby rozpocząć izolację nukleosomów, dodaj trzy mikrolitry 0,1 M chlorku wapnia do jąder komórkowych i umieść je w bloku grzejnym o temperaturze 37°C aż do wyrównania temperatury. Następnie dodaj dwie jednostki nukleazy mikrokokkowej w 10 µL buforu do nukleazy mikrokokkowej i inkubuj przez 12 minut w temperaturze 37°C. Często mieszaj roztwór za pomocą końcówki pipety.

Po inkubacji przerwać reakcję, dodając 6 µL 0,5 M EDTA-pH 8, i schłodzić na lodzie. Następnie odwirować próbkę z prędkością 2000 ×g przez 4 minuty; po wirowaniu odrzucić nadsącz i resuspendować osad w 300 µL 0,2 mM EDTA. Inkubować próbkę na lodzie przez jedną godzinę, okresowo delikatnie pipetując w celu wymieszania.

Po wirowaniu przy 3000 G przez cztery minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza, należy zebrać supernatant zawierający wolne nukleosomy do nowej probówki do wirowania i przechowywać na lodzie do późniejszego wykorzystania nukleosomów. Osad należy zawiesić w 300 µL 0,2 mM EDTA sodowego, tak jak wcześniej, i inkubować na lodzie przez jedną godzinę, wykonując okazjonalnie delikatne mieszanie.

Po inkubacji odwiruj próbkę w wirówce. Ponownie połącz otrzymany nadsącz z pozostałą częścią próbki w probówce do mikrowirówki na lodzie. Aby rozpocząć test ELISA dla nukleosomów, napełnij płytkę ELISA 96-dołkową malejącą serią pięciu dwukrotnych rozcieńczeń seryjnych nukleosomów w buforze do powlekania, zaczynając od 0,1 micrograms na 50 microliters w górnym dołku; wszystkie serie rozcieńczeń powinny być naniesione w trzech powtórzeniach.

Należy pamiętać o uwzględnieniu dopełniaczy zawierających wyłącznie bufor do powlekania jako kontroli. Inkubować płytkę przez noc w temperaturze 4 °C. Używając myjki do płytek, przemyć płytki 200 µL na dołek 0,5% między 20 w PBS w temperaturze pokojowej cztery razy, przez łącznie 10 minut.

Następnie do każdej studzienki dodaj 100 µL roztworu blokującego i inkubuj przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej na rotatorze. Po inkubacji usuń bufor blokujący, energicznie potrząsając odwróconą płytką nad zlewem. Następnie dodaj rozcieńczone przeciwciało pierwszorzędowe w objętości 50 µL na studzienkę w roztworze 5% PSA w 0,05% Tween 20 w PBS i inkubuj roztwór przez jedną godzinę na rotatorze w temperaturze pokojowej.

Po inkubacji z przeciwciałem pierwszorzędowym należy przemyć płytki w taki sam sposób jak poprzednio, używając myjki do płytek. Po zakończeniu procedury mycia należy dodać 50 µl na dołek przeciwciała wtórnego koniugowanego z peroksydazą chrzanową, rozcieńczonego w PBS z 5% BS, A oraz 0,5%20 i inkubować w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę na rotatorze. Po inkubacji z przeciwciałem wtórnym należy ponownie przemyć płytki w taki sam sposób jak wcześniej.

Użycie myjki do płytek w celu opracowania płytki. Do każdego dołka należy dodać 50 µL substratu TMB do testu ELISA i inkubować przez 10 minut. W temperaturze pokojowej dołki płytki ELISA zmienią kolor na niebieski, a intensywność zabarwienia będzie proporcjonalna do ilości modyfikacji nukleosomów obecnych w każdym z nich.

Następnie należy zatrzymać reakcję, dodając do każdej studzienki 50 µL kwasu siarkowego o stężeniu 2 N. Kolor zmieni się na brązowy. Płytkę należy odwirować przy 1500 RPM przez dwie minuty, aby usunąć pęcherzyki powietrza.

Płytka jest teraz gotowa do kwantyfikacji przy użyciu kolorymetrycznego czytnika płytek. Na koniec odczytaj wartość z płytki przy 450 nanometrach i wyeksportuj wyniki do analizy. Po opanowaniu tej techniki i jej właściwym opracowaniu, cały proces może zostać przeprowadzony w ciągu dwóch dni.

Technika ta otworzyła badaczom w dziedzinie komórek macierzystych drogę do badania odpowiedzi epigenetycznych na procesy różnicowania i reprogramowania na poziomie całego epi-proteomu.