Obrazowanie zarodków C. elegans przy użyciu mikroskopu epifluorescencyjnego i oprogramowania otwartoźródłowego

Niniejszy protokół demonstruje sposób obrazowania dynamicznych zdarzeń we wczesnych embrionach C. elegans z wykorzystaniem optyki Norky DIC lub fluorescencji, przy użyciu powszechnie dostępnych mikroskopów oraz oprogramowania otwartoźródłowego. Protokół rozpoczyna się od opisu sposobu preparowania embrionów C. elegans oraz ich montażu do obrazowania. Następnie omówiono prawidłową konfigurację optyki DIC Nor Masky, aby zapewnić uzyskanie obrazów o optymalnej jakości i najwyższym stopniu szczegółowości.

Omówiono również kalibrację szerokopolowego mikroskopu epifluorescencyjnego oraz oświetlenia w celu gromadzenia wysokiej jakości danych obrazowania fluorescencyjnego przy użyciu oprogramowania open source. Dobra mikroskopia pozwala na wizualizację dynamiki komórkowej w rozwijającym się embrionie. Ilustracje wizualne tej metody są kluczowe, ponieważ prawidłowa konfiguracja optyki DIC jest trudna, gdyż terminologia może być myląca, a właściwa technika jest trudna do opisania w formie pisemnej.

Ponadto badacze powinni dbać o zminimalizowanie ekspozycji na światło podczas obrazowania fluorescencyjnego. Aby ograniczyć fototoksyczność i fotoblaknięcie, w celu przygotowania embrionów do obrazowania, należy najpierw przygotować dwa roztwory montażowe. Pierwszym jest roztopiona wazelina, a drugim 2-3% agarozą w buforze.

Gęstsze agarosy można przygotować, jeśli obrazowane struktury są bardzo delikatne, dbając przy tym o to, aby uniknąć wrzenia. Oba roztwory stokowe należy rozpuścić w kuchence mikrofalowej, a następnie przechowywać w aliquotach o objętości od czterech do pięciu mililitrów. W dniu obrazowania należy rozpuścić aliquot roztworu wazeliny w bloku grzewczym o temperaturze od 65 do 70 °C oraz rozpuścić jeden aliquot roztworu agarosy w kuchence mikrofalowej.

Ponownie należy unikać doprowadzenia do wrzenia. Aby utrzymać te roztwory w stanie stopionym, należy przechowywać je w bloku grzejnym. Następnie górną i dolną powierzchnię dwóch szkiełek przedmiotowych należy zakleić paskiem taśmy laboratoryjnej i umieścić czyste szkiełko pomiędzy tymi dwoma zaklejonymi szkiełkami.

Następnie nanieś pipetą kilka kropli stopionego agarosu na czyste szkiełko przedmiotowe i przykryj je drugim czystym szkiełkiem. Agaroz rozprzestrzenia się, tworząc cienką kwadratową warstwę, w której przygotowuje się podłoże dla nicieni. Używając stereomikroskopu i platynowej igły, przenieś dwa dorosłe nicienie do kropli buforu o objętości od 9 do 12 µL na szkiełku nakrywkowe o wymiarach 18 na 18 mm.

Następnie należy wykonać cięcie. Rozciąć nicienie za pomocą igły lub skalpela, aby uwolnić embriony, trzymając stronę z agarem skierowaną w dół. Umieścić bloczek z nicieniami na szkiełku nakrywkowym o wymiarach 18 na 18 milimetrów i odciąć nadmiar agaru za pomocą żyletki.

Na koniec, aby uszczelnić szkiełko nakrywkowe, nanieś stopioną wazelinę wzdłuż jego obwodu za pomocą pędzla lub wykałaczki. Komórki są teraz gotowe do obrazowania. Umieszczając preparat na mikroskopie, upewnij się, że dwa polaryzatory są ustawione prostopadle względem siebie.

Upewnij się, że zarówno przysłony, jak i pryzmaty znajdują się poza torami światła. Jeśli pole widzenia nie jest ciemne, obracaj polaryzator pod kondensorem, aż stanie się ciemne. Zlokalizuj zarodki, korzystając z obiektywu 10x.

W poszukiwaniu większej liczby embrionów w polu obrazowania, należy szukać skupisk młodych embrionów w pobliżu ciał nicieni. Aby uzyskać najlepsze obrazy, należy unikać embrionów znajdujących się wewnątrz nicienia. Po zlokalizowaniu odpowiednich embrionów, należy przełączyć na obiektyw o większym powiększeniu.

Teraz przełącz kostkę filtra na DIC. Następnie wsuń górny pryzmat Wollastona obiektywu do toru światła i obróć tarczę kondensora, aby wybrać dolny pryzmat Wollastona dopasowany do obiektywu. Po umieszczeniu pryzmatów dostosuj suwak pod tą tarczą do apertury numerycznej soczewki.

Aby uzyskać optymalne oświetlenie Köhlera, ustaw ostrość kondensora, aż krawędź przysłony kondensora stanie się najostrzejsza. Najostrzejsza krawędź to taka, w której granica między światłem a czernią jest najbardziej wyraźna lub najlepiej wyostrzona. Aby uzyskać optymalny kontrast, wyreguluj ściankę aperturową i pryzmę, obracając pokrętło suwaka.

Mikroskop jest już niemal gotowy do użycia. Nadszedł czas, aby za pomocą programu MicroManager oraz oprogramowania otwartoźródłowego kontrolować dodatkowe parametry obrazowania na komputerze. Rozpocznij od ustawienia wzmocnienia kamery na zero.

Następnie zmień ustawienia zapisu plików na format TIFF 8-bitowy zamiast 16-bitowego. Pliki TIFF mogą być później analizowane za pomocą oprogramowania open source, takiego jak Image J. W kolejnym kroku dostosuj poziom oświetlenia tak, aby najjaśniejsze piksele znajdowały się tuż poniżej poziomu nasycenia. Jeśli wszystkie czynności zostały wykonane prawidłowo, obraz będzie sprawiał wrażenie trójwymiarowego, z efektem światła padającego pod kątem.

Gdy obraz będzie już wyraźny, należy wybrać embriony przeznaczone do obrazowania i wyznaczyć obszar zainteresowania (ROI). Jeśli mikroskop jest wyposażony w silnik ostrości, należy go wykorzystać do zarejestrowania wielu płaszczyzn ogniskowych w każdym punkcie czasowym. Otwórz okno akwizycji wielowymiarowej i ustaw górną oraz dolną płaszczyznę stosu Z, regulując pokrętło ostrości tak, aby odnaleźć pierwszą i ostatnią płaszczyznę ogniskową, na której widoczne są ziarnistości żółtka.

Ustaw wielkość kroku. Określi to liczbę rejestrowanych płaszczyzn ogniskowych. Następnie ustaw przedział czasowy wystarczająco długi, aby możliwe było zarejestrowanie wszystkich płaszczyzn ogniskowych.

Maksymalny czas trwania może zostać ustawiony na bardzo wysoką wartość, tak aby oprogramowanie wykonywało zdjęcia aż do momentu ręcznego zatrzymania. Skonfiguruj oprogramowanie tak, aby wyświetlało tylko ostatnio wykonane zdjęcie, co umożliwi monitorowanie procesu. Następnie nadaj plikom z obrazami nazwę i rozpocznij akwizycję zdjęć.

Analiza obrazów zostanie krótko omówiona na końcu następnej sekcji. Tworzenie filmu z GFP przypomina tworzenie filmu 4D w DIC, jednak stosowany jest plik konfiguracyjny obejmujący sterowanie programowe migawką fluorescencyjną. Po zlokalizowaniu embrionów należy upewnić się, że górny pryzmat nie znajduje się na drodze światła, a następnie przełączyć kostkę filtra na F-I-T-C-G-F-P.

Jeśli nie zostało to ustawione automatycznie podczas uruchamiania oprogramowania, upewnij się, że wzmocnienie kamery jest ustawione na 255. Plik obrazu zostaje ustawiony w formacie 16-bitowym tiff. Teraz wyłącz źródło światła przechodzącego i kliknij obrazowanie na żywo.

Dostosuj natężenie źródła światła UV oraz czas ekspozycji, aby uzyskać korzystny stosunek sygnału do szumu dla sygnału fluorescencyjnego, dbając jednocześnie o to, by ekspozycja na światło była minimalna w celu zachowania żywotności komórek. Następnie ustaw odstępy czasowe, liczbę punktów czasowych oraz liczbę płaszczyzn ogniskowych, a następnie przystąp do akwizycji obrazów zgodnie z wcześniejszym opisem.

Do analizy filmów należy użyć oprogramowania open source. Image J z zainstalowaną wtyczką micromanager. Bardzo duże filmy można również zaimportować do Image J za pomocą wtyczki loci. Przedstawiony zarodek typu dzikiego został zarejestrowany przy użyciu nor masky i optyki DIC.

Tył znajduje się w prawym dolnym rogu, a strona brzuszna w lewym dolnym rogu. Film przedstawia sekwencję obrazów z jednej płaszczyzny ogniskowej, rejestrowanych co 15 sekund. Szybkość odtwarzania wynosi 14 klatek na sekundę.

Zarodek ten wykazuje fluorescencję podczas pierwszego podziału embrionalnego; koniec tylny znajduje się w prawym górnym rogu. Film przedstawia zmiany w jednej płaszczyźnie ogniskowania co 10 sekund. Po obejrzeniu tego materiału powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat obrazowania żywych zarodków z wykorzystaniem optyki DIC Naski oraz epi-fluorescencji w celu badania zjawisk dynamicznych.

Mamy nadzieję, że lepiej rozumieją Państwo sposób konfiguracji optyki DIC Nomar w celu uzyskania optymalnych obrazów i zdali sobie sprawę, że wysokiej jakości dane fluorescencyjne można uzyskać dzięki oświetleniu epifluorescencyjnemu, nie będąc zawsze zależnym od bardziej zaawansowanych mikroskopów. Można również zastosować te techniki obrazowania do badania zarodków pozbawionych funkcji konkretnych genów, aby dalej badać wymagania genetyczne dla wybranych zdarzeń podczas podziału komórek lub rozwoju.