Analiza transkryptomu pojedynczych komórek
25 kwietnia 2011
W niniejszym artykule opisujemy prostą metodę izolacji pojedynczych komórek z pierwotnych kultur neuronalnych szczura oraz późniejszą analizę transkryptomu z wykorzystaniem amplifikacji aRNA. Metoda ta może zostać zastosowana do każdego typu komórek.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest przygotowanie próbek z pojedynczych komórek do analizy transkryptomu. Jest to realizowane poprzez najpierw odnalezienie komórki odpowiedniej do izolacji. Następnie mikro pipetę ustawia się obok komórki przeznaczonej do izolacji.
Następnie przyłożono ssanie do strzykawki, aż komórka została wciągnięta do końcówki mikropipety. Ostatnim krokiem procedury jest odłamanie końcówki mikropipety do probówki zbiorczej i wydrukowanie pozostałej zawartości mikropipety do probówki. W rezultacie można uzyskać wyniki wykazujące różnice w populacjach mRNA między komórkami poprzez analizę mikroarrays materiału amplifikowanego metodą amplifikacji arna, opisaną również w protokole, lub do innych zastosowań, takich jak PCR lub sekwencjonowanie nowej generacji.
Choć metoda ta może dostarczyć wglądu w różnice między pojedynczymi komórkami, można ją również zastosować do przedziałów subkomórkowych, takich jak dendryty lub klasy dendrytów, co dostarcza istotnych informacji na temat funkcji dendrytów. Procedurę zaprezentuje Jennifer Singh, postdok w moim laboratorium. Przed rozpoczęciem niniejszego protokołu, pierwotne neurony z hipokampa szczura z 18. dnia embrionalnego zostały wysiane na szkiełka nakrywkowe o średnicy 12 mm w szalce 35 mm i utrzymywane zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Aby przygotować pipety do zbioru, należy użyć mikrowyciągacza do pipet, aby wyciągnąć autoklawowane pipety szklane do średnicy odpowiedniej dla elektrofizjologii.
Przy użyciu programu predefiniowanego przez producenta średnica otworu nie jest istotna, ponieważ końcówka zostanie odłamana przed pobraniem komórek. Pipety należy ostrożnie przechowywać w środowisku wolnym od kurzu, na przykład w słoiku do przechowywania mikropipet, aby końcówki pozostały nienaruszone do momentu zbierania komórek. Przygotować odpowiednią liczbę probówek typu einor o pojemności 1,7 ml, dodając 2 µL PBS w celu przechowywania pobranego materiału.
Wyjmij z inkubatora w komorze do hodowli tkanek jedną szalkę o średnicy 35 mm z szkiełkami nakrywkowymi. Szybko przenieś jedno szkiełko nakrywkowe z tej szalki na pokrywkę nowej szalki o średnicy 35 mm zawierającej HBSS. Niezbędne jest bezzwłoczne zwrócenie pozostałych szkiełków nakrywkowych do inkubatora, ponieważ komórki mogą utracić żywotność.
W przypadku pozostawienia na dłuższy czas. Do zbioru komórek niezbędny jest odwrócony mikroskop świetlny z obiektywem 40x oraz zamontowanym mikromanipulatorem. Należy użyć uchwytu do pipety z elastycznym przewodem prowadzącym od uchwytu; przewód ten należy przymocować do stabilnej powierzchni, aby zapobiec niepożądanemu przemieszczaniu się pipety podczas zbierania.
Na końcu rurki należy umieścić igłę w taki sposób, aby można było przymocować i wymieniać między użytkownikami strzykawkę o pojemności 1 mL z połączeniem Luer-Lock. Mikropipetę przygotowuje się poprzez kontrolowane ścięcie końcówki: należy naciągnąć chusteczkę Kim wipe między palcami jednej ręki i bardzo delikatnie przesunąć końcówkę pipety po papierze jeden lub dwa razy. Otwór powinien mieć wielkość około 75 do 100% rozmiaru docelowej komórki.
Zabeziecz mikropipetę w uchwycie do mikropipet i przymocuj uchwyt do elementu mocującego mikromanipulatorów. Następnie ustaw obiektyw 40x. Umieść szalkę na stole mikroskopu i znajdź obszar komórek odpowiedni do zbioru.
W przypadku pierwotnych kultur neuronalnych komórka powinna być stosunkowo odseparowana od sąsiednich komórek. Aby zapobiec pobraniu sąsiednich komórek lub ich wypustek, należy umieścić komórkę przeznaczoną do pobrania w centrum pola widzenia. Za pomocą mikromanipulatora należy przesunąć mikropipetę w stronę roztworu w naczyniu, wprowadzając ją w tor światła.
Zanurz końcówkę pipety w roztworze. Patrząc przez okular, pipeta powinna być widoczna jako cień w polu widzenia. Od tego momentu przykładaj nadciśnienie, delikatnie dmuchając przez strzykawkę znacznie powyżej płaszczyzny komórek.
Dostosuj położenie końcówki pipety tak, aby znalazła się ona w polu widzenia, a następnie ustaw ostrość na końcówkę, korzystając z pokręteł grubego ustawiania. W tym momencie oceń, czy średnica otworu pipety jest zbyt duża lub zbyt mała. Jeśli średnica otworu jest nieprawidłowa, wymień mikropipetę na inną, aż do znalezienia odpowiedniej średnicy, aby zapobiec pęknięciu pipety w obszarze poboru.
Użyj pokrętła ostrości wstępnej, aby przesunąć płaszczyznę ogniskowej, a następnie skieruj końcówkę pipety w stronę komórek za pomocą mikromanipulatorów. Gdy komórki znajdą się bliżej, użyj ostrości precyzyjnej, aż zarówno komórki, jak i końcówka pipety będą ostre. Przestań przykładać dodatnie ciśnienie przed dotarciem do komórek, aby uniknąć ich zdmuchnięcia z lamielki.
Używając mikromanipulatorów, ustaw końcówkę pipety tak, aby dotykała ona somy komórki przeznaczonej do pobrania. Za pomocą strzykawki, delikatnie zassać komórkę ustami, aż dostanie się ona do końcówki pipety. Jeśli komórka nie wchodzi do pipety, ostrożnie przesuń końcówkę bliżej komórki i w dół, aż komórka oderwie się od szkiełka nakrywkowego.
Użyj mikromanipulatora, aby natychmiast przesunąć pipetę w górę i wyjąć ją z roztworu. Wyjmij pipetę z uchwytu. Trzymając przygotowaną probówkę typu einor o pojemności 1,7 mililitra w jednej ręce, delikatnie odłam końcówkę pipety o ściankę probówki w pobliżu jej dna.
Kierując się w stronę oznaczenia 0,1 mililitra, z końcówką złamanej pipety wycentrowaną wewnątrz probówki, wprowadź igłę przymocowaną do strzykawki o pojemności jednego mililitra do górnego otworu pipety. Gwałtownie naciśnij tłok, wymuszając rozpylenie roztworu z pipety do probówki. Należy uważać, aby końcówka nie dotknęła cieczy znajdującej się na ściankach probówki.
Ponieważ siły kapilarne przyciągną ciecz z powrotem do pipety, komórka powinna pozostać na samym końcu końcówki, co powinno być wystarczające do prawidłowego wydmuchania komórki. Szybko odwiruj zawartość probówki w mikrowirówce nakładkowej i zamroź na suchym lodzie lub umieść na lodzie w celu dalszego przetwarzania lub do innych zastosowań, takich jak PCR lub sekwencjonowanie nowej generacji. Przedstawiono tutaj przykład udanego pozyskania izolowanego neuronu.
W pierwszej kolejności wybrano obszar o stosunkowo niskiej gęstości komórek. Następnie końcówkę pipety przesunięto w stronę wybranej komórki. Tutaj przedstawiono pole widzenia po pobraniu komórki.
Należy zauważyć, że otaczające procesy pozostają na szkiełku podstawowym. Z kolei na tej ilustracji przedstawiono dwa obrazy końcówek pipet, których rozmiar jest niewłaściwy do efektywnego zbierania. Zastosowanie tej końcówki doprowadzi do niepełnego zbioru, natomiast końcówka pokazana tutaj spowoduje zebranie otaczającego środowiska.
Po zbiorze i amplifikacji RNA zaleca się przeprowadzenie analizy przy użyciu bioanalizatora w celu zbadania rozkładu i ilości amplifikowanego RNA. Pomyślna amplifikacja z materiału pojedynczej komórki pozwoli uzyskać całkowitą ilość rzędu kilku mikrogramów oraz gładki i szeroki rozkład. Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, można ją zrealizować w ciągu kilku minut. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest stosowanie technik wolnych od RNaz.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia metodę izolowania pojedynczych komórek z pierwotnych kultur neuronów szczura w celu analizy transkryptomu z wykorzystaniem amplifikacji aRNA. Technika ta jest możliwa do zaadaptowania do różnych typów komórek, co pozwala na szczegółowe badanie ekspresji genów na poziomie pojedynczych komórek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Transkryptomika
Wstęp
- Analiza pojedynczych komórek pozwala na poznanie heterogeniczności komórkowej.
- Zrozumienie różnic w ekspresji genów jest kluczowe dla badań z zakresu neuronauki.
- Pierwotne hodowle neuronów są niezbędne do badania funkcji neuronalnych.
- Techniki pozyskiwania materiału są istotne dla dokładnej analizy transkryptomu.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnej metody izolacji pojedynczych neuronów.
- Ułatwienie analizy transkryptomu pojedynczych komórek.
- Pogłębienie wiedzy na temat zmienności ekspresji genów w neuronach.
Zastosowane metody
- Izolacja pojedynczych komórek przy użyciu technik mikropipetowania.
- Zastosowanie amplifikacji aRNA do analizy transkryptomu.
- Wykorzystanie odwróconego mikroskopu świetlnego do wizualizacji komórek.
- Mikromanipulator do precyzyjnego pozycjonowania pipety.
Główne wyniki
- Skuteczna izolacja pojedynczych neuronów z kultur pierwotnych.
- Wykazanie różnic w populacjach mRNA pomiędzy izolowanymi komórkami.
- Potencjalne zastosowania w PCR i sekwencjonowaniu nowej generacji.
- Wgląd w funkcje dendrytów poprzez ukierunkowane pobieranie materiału.
Wnioski
- Metoda ta umożliwia szczegółową analizę transkryptomiczną na poziomie pojedynczych komórek.
- Można ją dostosować do różnych typów komórek poza neuronami.
- Podejście to pogłębia nasze zrozumienie różnorodności komórkowej w tkankach neuronalnych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Analiza transkryptomu pojedynczych komórek pozwala zespołom biofarmaceutycznym na rozstrzygnięcie heterogeniczności komórkowej i odkrycie różnic w ekspresji genów, które są maskowane w analizach tkanki zbiorczej. Możliwość ta jest kluczowa dla walidacji celów terapeutycznych, ograniczania ryzyka mechanistycznego oraz priorytetyzacji populacji komórek istotnych dla danej choroby we wczesnej fazie odkrywania leków. Integracja solidnych przepływów pracy w analizach pojedynczych komórek zwiększa pewność predykcyjną i wspomaga decyzje dotyczące selekcji projektów w portfolio.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia analizę ekspresji genów z rozdzielczością pojedynczych komórek, co pozwala wyjaśnić aktywność szlaków i zaangażowanie celu.
- Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez rozróżnianie sygnatur molekularnych między typami komórek a przedziałami wewnątrzkomórkowymi.
- Zwiększa pewność predykcyjną w wyborze celu poprzez ujawnienie heterogeniczności w tkankach istotnych dla danej choroby.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Ułatwia przygotowanie zwalidowanych próbek pojedynczych komórek do dalszych analiz transkryptomicznych.
- Umożliwia powtarzalną izolację i amplifikację RNA z pojedynczych komórek, co wspiera opracowywanie analiz ilościowych.
- Zapewnia skalowalny materiał wejściowy dla platform mikromacierzy, PCR lub sekwencjonowania nowej generacji.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia powiązanie profilowania molekularnego z odpowiednimi dla choroby podtypami lub przedziałami neuronalnymi, wspierając odkrywanie translacyjnych biomarkerów.
- Zapewnia ciągłość od wczesnej fazy odkrywania po walidację przedkliniczną dzięki możliwości przeprowadzania analiz z rozdzielczością na poziomie pojedynczych komórek.
- Zmniejsza ryzyko promowania niereprezentatywnych celów poprzez potwierdzenie ich ekspresji w odpowiednich populacjach komórek.
Integracja potoków i przepływów pracy
Ten schemat izolacji pojedynczych komórek i amplifikacji aRNA łączy wczesny etap odkrywania z badaniami przedklinicznymi, dostarczając wysokorozdzielczych danych transkryptomicznych do walidacji celów oraz identyfikacji związków wiodących.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez umożliwienie analizy ekspresji genów na poziomie pojedynczych komórek.
- Screening: Dostarcza powtarzalne, ilościowe produkty RNA, odpowiednie do późniejszych analiz wysokoprzepustowych.
- Analityka: Generuje amplifikowane RNA do mikromacierzy lub sekwencjonowania, co umożliwia rzetelne porównanie ekspresji genów w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia molekularne z podtypami lub przedziałami neuronalnymi istotnymi dla danej choroby.
- Zastosowania przedsiębiorstwa: Zapewnia zestandaryzowany, adaptowalny schemat postępowania dla różnych typów komórek i modeli eksperymentalnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje izolację i amplifikację pojedynczych komórek, poprawiając powtarzalność i skalowalność.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji go/no-go i zmniejsza biologiczne ryzyko na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój celów o potwierdzonej istotności komórkowej.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w pracy z pojedynczymi komórkami oraz zastosowania technik wolnych od RNA w celu zapobiegania kontaminacji.
- Wymaga dostępu do aparatury do mikromanipulacji oraz platform analitycznych do ilościowego oznaczania i analizy RNA.
- Wymaga standaryzacji protokołów izolacji i amplifikacji pomiędzy zespołami w celu zapewnienia powtarzalności.
- Metoda jest możliwa do adaptacji do różnych typów komórek i przedziałów subkomórkowych poprzez modyfikacje protokołu.
- Integralność próbek i wydajność RNA są wrażliwe na sposób obchodzenia się z materiałem oraz czas, co wymaga starnego zarządzania przebiegiem prac.
