Mapowanie i zastosowanie ekspresji flippazy w pułapkach enhancerów w OUN larw i dorosłych osobników Drosophila

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest doprecyzowanie ekspresji GAL4 poprzez zastosowanie specyficznej tkankowo lipazy wraz z narzędziami konwertującymi GAL80. Osiąga się to poprzez wygenerowanie kolekcji transgenicznych linii much Philippe z pułapką enhancerową oraz określenie wzorca ekspresji lipazy w obrębie OUN w każdej z linii. Wykorzystując reporter GFP, immunochemia i raporty GFP pozwalają odróżnić ekspresję gliaльную od neuronalnej, aby przeciąć ekspresję GAL4 w interesujących liniach ET flip w potomstwie much zawierających narzędzie konwertujące GAL80.

Analiza klonalna może być wykorzystana do badania precyzji ekspresji GAL4, na przykład w oku. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest możliwość wykorzystania linii opartych na śledzeniu enhancerów wraz z narzędziami konwertującymi GAL80, co pozwala na szybkie korzystanie z szerokiej kolekcji linii GAL4 dostępnej już w społeczności badaczy muchy owocówki. Ponadto koncepcja ta może zostać rozszerzona na inne organizmy modelowe wykorzystujące system UAS/GAL4, takie jak zebrafish.

Ta metoda może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące mapowania obwodów neuronalnych leżących u podstaw zachowań. Chociaż niniejszy protokół demonstruje zastosowanie flip base w podgrupie komórek fotoreceptorów, metoda intersekcyjna może zostać zastosowana do analizy innych tkanek, w tym tkanek pozaneuronalnych, w miarę charakteryzacji kolejnych linii enhancer trap lipase.

System GAL4/UAS jest istotną techniką powszechnie stosowaną przez biologów badających muchy. Jednym z ograniczeń większości linii GAL4 jest zbyt szeroka ekspresja, która uniemożliwia mapowanie zachowań w mózgu z wykorzystaniem metod funkcjonalnych. Przed zastosowaniem transgenu FLP-out w celu częściowego ograniczenia ekspresji linii GAL4, nie jest możliwe precyzyjne dostrojenie ekspresji GAL4 w interesujących badacza tkankach.

W pierwszej kolejności warto poznać wzorzec ekspresji transgenu ET flip x two w późnych stadiach rozwoju larw oraz u osobników dorosłych, aby zwizualizować ekspresję flip a w OUN. Przeprowadź krzyżówkę między samcami z interesującym transgenem ET t flip X two a dziewiczymi samicami posiadającymi reporter GFP dla ekspresji et flip. Z potomstwa wybierz wędrujące larwy trzeciego stadium F1 do sekcji. Umieść je w czystej szalce S guard, usuń wszelkie zanieczyszczenia pędzelkiem i wypłucz szalkę raz roztworem 1x PBS.

Następnie napełnij naczynie lodowatym 1x PBS, aby znieczulić larwy. Aby uzyskać dostęp do OUN larwy, przytrzymaj haczyk gębowy za pomocą pęsety. Chwyć kutykulę w pobliżu wysuniętej przedniej sfery i odchyl ją do tyłu. OUN pozostaje przytwierdzony do haczyka gębowego wraz z niektórymi innymi strukturami.

Następnie za pomocą pęsety usuń wszystkie nadmiarowe struktury otaczające OUN podczas jego preparowania. Przenoś je pojedynczo do naczynia Pyrex wypełnionego PBS. Po wypreparowaniu wszystkich OUN utrwal je, całkowicie zanurzając w 200 µL 4% PFA w temperaturze 0°C.

Jeśli OUN pływa, oznacza to, że nie został całkowicie oczyszczony z otaczających go tkanek. W takim przypadku należy użyć pincety, aby ponownie zanurzyć OUN w utrwalaczu na 15 minut, przemyć tkankę lodowatym PBS 3 razy, a następnie trzykrotnie przemyć tkankę lodowatym PBT. Tkanka jest teraz gotowa do obrazowania, znakowania przeciwciałami lub przechowywania w PBT w temperaturze czterech stopni Celsjusza do późniejszego użycia.

Barwienie z tego samego krzyżowania, które służyło do pozyskania larw, w celu zebrania dorosłych osobników F1 przed sekcją. Zanurzono od pięciu do 10 much w schłodzonym 95% etanolu na 30 sekund, aby usunąć wosk z powierzchni kutykuli. Aby usunąć etanol, przemyto dorosłe osobniki trzykrotnie lodowatym 1x PBS, a po trzecim przemyciu przeniesiono jednego z nich do 35-milimetrowej szalki typu sil guard wypełnionej lodowatym 1x PBS, aby przygotować osobnika do sekcji.

Umieść go stroną brzuszną do góry i wetknij szpilkę entomologiczną w połowie długości odwłoka. Rozpocznij sekcję, używając pęsety do usunięcia nóg. Następnie usuń kutykulę głowy, unieruchamiając głowę w podpórkach i jednocześnie odrywając kutykulę od spodu oka w kierunku czubka głowy.

Używając ostrożnie zaostrzonych pęsety, usuń i odsuń tkanki otaczające mózg, ponieważ tkanki te wykazują silną autofluorescencję, co powoduje unoszenie się mózgu podczas utrwalania. Mózg jest tylko częścią dorosłego OUN. Pozostałą częścią jest brzuszny sznur nerwowy (VNC) w klatce piersiowej, który również musi zostać wypreparowany.

Po pierwsze, usuń kutykulę klatki piersiowej, unieruchamiając muchę u nasady tylnej nogi i delikatnie odciągając kutykulę klatki piersiowej aż do podstawy szyi. Po drugie, aby odsłonić VNC, delikatnie rozsuń dwie połowy kutykuli klatki piersiowej. Po trzecie, oddziel odwłok od klatki piersiowej, unieruchamiając muchę u nasady drugiej nogi i odciągając odwłok w okolicy pierwszego segmentu odwłoka.

Po czwarte, oczyść VNC, chwytając go w okolicy ramiennej i delikatnie odrywając tkankę otaczającą VNC. Rozdziel pierścień tkanki łącznej otaczający połączenia szyjne i kontynuuj usuwanie nadmiaru tkanki podczas pobierania mózgu. Przenieś mózg i VNC w parach do płytki Pyrex o średnicy 9 cm wypełnionej schłodzonym 1x PBS i utrzymywanej w lodzie.

Aby utrwalić tkanki dorosłych osobników, należy zanurzyć je w 4% PFA w temperaturze 0°C na 15 minut. Następnie przeprowadzić trzy płukania w lodowatym PBS oraz trzy płukania w PBT. Tkanka jest teraz gotowa do obrazowania lub znakowania przeciwciałami w celu dokładnej analizy ekspresji transgenu.

W celu stworzenia układu odniesienia warto znakować OUN markerami neuronalnymi lub glejowymi; należy rozpocząć od inkubacji tkanki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc z przeciwciałami przeciwko neuronom lub glejowi. Następnego dnia preparat należy przemyć pięciokrotnie w PBT i inkubować z fluorescencyjnym przeciwciałem wtórnym w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. Po zakończeniu inkubacji płytkę należy owinąć folią, aby zapobiec fotoblakaniu przeciwciał.

Przemyj preparat PBS i zamocuj go w całości na szkiełku. Użyj plastikowego pierścienia OSHA, aby zapobiec zgniataniu tkanki przez szkiełko nakrywkę. Układ nerwowy jest teraz gotowy do badania wzorców ekspresji GFP i LL pod mikroskopem fluorescencyjnym.

Zazwyczaj bada się od trzech do pięciu powtórzeń, aby określić powtarzalność wzorca ekspresji flip. Wzorzec ekspresji flip w linii flip może być wykorzystywany wraz z innymi transgenami do zmiany sposobu ekspresji represora GAL 80 z GAL4. Zmiana ekspresji represora GAL 80 jest skuteczną metodą wprowadzania modyfikacji.

W przypadku ekspresji GAL4 jedną z metod jest usunięcie (flip-out) ekspresji GAL80 za pomocą transgenu; ekspresja GAL80 inaktywuje GAL4, który w przeciwnym razie powoduje degenerację oka w całej jego strukturze. Linia ET flip hash 6 88 A została tutaj wykorzystana do oceny skuteczności narzędzia konwertującego GAL80 w podzbiorze fotoreceptorów w potomstwie F1, poprzez porównanie fenotypu oka z fenotypem oka szczepów rodzicielskich. Wszelka obecność deformacji oka lub depigmentacji potwierdza, że wzór ekspresji flip występuje w fotoreceptorach, a usunięcie (flip-out) GAL80 przebiegło pomyślnie.

Uzupełniającą, nieredundantną strategią jest wprowadzenie ekspresji GAL 80 przy użyciu tej samej linii flip, która jest przedmiotem zainteresowania. Strategia ta jest bardzo podobna do poprzedniej, jednak w tym przypadku pigmentacja ID oraz degeneracja w potomstwie F1 są zahamowane. W flip X dwa.

Ekspresja fotoreceptorów. Po opanowaniu techniki, sekcja OUN może zostać przeprowadzona w około pięć minut w przypadku osobników dorosłych i jedną minutę w przypadku larw, pod warunkiem prawidłowego wykonania. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest użycie ostrych pincet do usunięcia tchawic oraz tkanek otaczających zarówno dorosłe osobniki, jak i Libre C i Ss. Do sekcji należy używać naczynia wolnego od utrwalacza. W celu generowania losowych klonów obecnie stosuje się metodę szoku termicznego (heat shock flip).

W przeciwieństwie do tego, metoda enhancer trap flip pozwala na generowanie powtarzalnych klonów, co ułatwia analizę morfologiczną i behawioralną. Inną zaletą metody finger jest możliwość dalszego ograniczania wzorców ekspresji GAL4 poprzez wykorzystanie dodatkowych linii opartych na anan trap flip oraz innych linii gal. Słabością konfiguracji tubulin stop GAL80 jest fakt, że niektóre kombinacje efektorów GAL4 i UAS, takich jak LAG4 i U-A-S-K-I-R, są niekompatybilne, ponieważ prowadzą do śmierci much.

Problem ten można łatwo rozwiązać, stosując warunkowy efektor UAS, taki jak UAS Shiri Ts, który pozwala na badanie zachowania w temperaturach restrykcyjnych. Zgodnie z przewidywaniami, nie wszystkie linie lipazy z pułapką wzmacniacza będą wykazywać wystarczająco wysoki poziom ekspresji lipazy, aby były użyteczne. Niemniej jednak, opisana tutaj technika palca stanowi nowe podejście dla badaczy Drosophila w celu doprecyzowania analizy mozaikowej, zarówno w odniesieniu do obwodów rozwojowych, jak i zachowania.