Procedura inżynierii płuc

Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie w kulturze tkanki płucnej, która jest morfologicznie i fizjologicznie porównywalna z natywną tkanką płucną. Osiąga się to poprzez uprzednie pobranie serca i płuc od dorosłego szczura. Kolejnym krokiem jest kaniulacja tętnicy płucnej oraz tchawicy i podłączenie kaniulowanych płuc do bioreaktora w celu przeprowadzenia decelularyzacji.

Po decelularyzacji i płukaniu płuco przenosi się do sterylnego bioreaktora hodowlanego i przygotowuje do zasiewu. Ostatnim krokiem procedury jest zasianie odpowiedniego odcinka płuca przygotowaną populacją komórek. W rezultacie można uzyskać wyniki wykazujące, że decelularyzowana macierz pozakomórkowa została wydajnie repopulowana komórkami wykazującymi regionalnie specyficzne markery płucne w badaniu mikroskopii immunofluorescencyjnej.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami hodowli komórek płuc in vitro jest fakt, że komórki utrzymują zróżnicowane fenotypy przez dłuższy czas, co pozwala na ich badanie przez kilka tygodni w trójwymiarowym podłożu pochodzenia biologicznego. W celu decelularyzacji płuca są połączone z pokrywą bioreaktora za pomocą kaniuli naczyniowej, a pokrywa jest podłączona do aparatury do decelularyzacji. Szklana butelka znajdująca się nad płucami jest utrzymywana w miejscu za pomocą statywu z pierścieniem i przymocowanego zacisku.

Na tym etapie materiał komórkowy może zostać usunięty w celu wytworzenia rusztowania macierzy pozakomórkowej, które można ponownie zasiedlić materiałem komórkowym. Schemat ten przedstawia montaż bioreaktora do siewu i hodowli inżynieryjnej tkanki płucnej. Złącze Luer-Lock kaniuli tchawiczej łączy się z pętlą oddechową pomiędzy zbiornikiem tchawiczym a komorą główną.

Pętla oddechowa zawiera dwa zawory jednokierunkowe. Są one rozmieszczone tak, aby medium przepływało różnymi drogami do płuc i z płuc. Do linii perfuzyjnej tymczasowo włączono mały zbiornik w celu zasiewu komórek śródbłonka.

Pompa pulsacyjna służy do transportu komórek z rezerwuaru do przedziału naczyniowego płuca. Perfuzja naczyniowa jest realizowana za pomocą pompy perystaltycznej. Medium jest perfundowane do tętnicy płucnej za pomocą przymocowanej kaniuli, przepływa przez układ naczyniowy płuc i wypływa przez żyłę płucną bezpośrednio do głównego bioreaktora, z którego medium jest pobierane do dalszej perfuzji.

Nabłonek płucny jest umieszczany w pętli oddechowej za pomocą zastrzyku. Główna komora zawierająca płuco oraz zbiornik tchawicy są wykorzystywane do długoterminowej hodowli płuc. Po wyjęciu płuc i prawidłowym kaniulowaniu tętnicy oraz tchawicy, świeżo wyekstrahowane płuca powinny utrzymywać powietrze bez wycieków.

Można to zweryfikować, pompując do nich powietrze podczas zanurzenia w cieczy. Nie powinny pojawić się żadne pęcherzyki wskazujące na wycieki powietrza. Aby rozpocząć protokół, płuca napompowuje się roztworem PBS zawierającym nitroprusyd sodu, aż zostaną całkowicie wypełnione, ale nie przepełnione, a następnie natychmiast zamyka się kaniulę tchawiczą, aby płuca pozostały napompowane.

Następnie należy przeprowadzić perfuzję płuc roztworem PBS i SNP przez co najmniej 15 minut pod ciśnieniem 15 mmHg. Po tym czasie należy wyjąć korek z kaniuli tchawiczej, aby umożliwić rozprężenie płuc. W razie potrzeby kontynuować perfuzję PBS i SNP przez okres od 15 do 30 minut.

Uzupełnij PBS i SNP, aby zapewnić utrzymanie ciśnienia perfuzji na poziomie od 10 do 15 milimetrów słupa rtęci. Aby rozpocząć procedurę długotrwałej decelularyzacji, pokrywkę bioreaktora należy podłączyć do aparatury do decelularyzacji. Następnie płuca zostają podłączone do pokrywki.

Używając złączy Luer Lock połączonych z kaniulą w kształcie litery Y, kaniulę tętnicy płucnej należy podłączyć do linii perfuzyjnej, natomiast kaniulę tchawiczą należy pozostawić wolną. Aby zapewnić pełną decelularyzację tkanki, kluczowe jest niedopuszczenie powietrza do układu. Zawory jednokierunkowe w kaniuli tętniczej i tchawiczej pomagają usunąć pęcherzyki powietrza z cewników poprzez umożliwienie przepływu zwrotnego w przewodach.

W związku z tym należy usunąć pęcherzyki powietrza za pomocą strzykawki, upewniając się, że wszystkie linie są wolne od powietrza. Rozpocząć perfuzję roztworem do decelularyzacji. Przeprowadzić perfuzję roztworem do decelularyzacji.

Do momentu, gdy przez płuca przepłynie 500 ml roztworu, optymalne ciśnienie powinno być niższe niż 15 mmHg. Zazwyczaj wymaga to 2,5 godziny. Szybkość przepływu jest początkowo bardzo niska, a w drugiej godzinie gwałtownie wzrasta do około 1 ml/min lub więcej.

W trakcie perfuzji okresowo usuwaj zużyty płyn do decelularyzacji z bioreaktora, upewniając się, że pozostała ilość płynu jest wystarczająca do podtrzymania płuca i kaniuli tchawiczej. Po zakończeniu perfuzji płynem do decelularyzacji przenieś płuca i bioreaktor do komory z laminarnym przepływem powietrza. Aby rozpocząć płukanie organu, wyjmij słoik o pojemności 500 mililitrów zawierający płyn do decelularyzacji i zastąp go sterylnym słoikiem zawierającym do jednego litra sterylnego PBS.

Użyj ssania próżniowego lub strzykawki, aby upewnić się, że w liniach nie ma powietrza, a następnie w ten sam sposób przepłucz naczynia krwionośne roztworem PBS pod ciśnieniem od 10 do 15 mmHg. Podobnie jak podczas decelularyzacji, stosując techniki sterylne, okresowo usuwaj zużyty PBS z bioreaktora i wymieniaj lub uzupełniaj słoik z PBS. Kontynuuj płukanie świeżym, sterylnym PBS, aż przez płuca zostanie przepłukane co najmniej 2,5 litra sterylnego PBS.

Zazwyczaj potrwa to dwa dni od rozpoczęcia procesu decelularyzacji do momentu zakończenia płukania. Przenieś płuca do nowego sterylnego systemu bioreaktora zawierającego świeży PBS z dodatkiem 10%FBS oraz 10%Pen strep; upewnij się, że zarówno cały obwód perfuzyjny, jak i wszystkie linie dróg oddechowych są wypełnione płynem. Od tego momentu należy użyć pompy pulsacyjnej do perfuzji płuc z prędkością 5 mm/min.

Sterylizować rusztowanie macierzy zewnątrzkomórkowej płuc poprzez nocną perfuzję buforem PBS z dodatkiem 10% FBS i 10% penicyliny i streptomycyny. Po zakończeniu tego etapu przenieść płuca do inkubatora w temperaturze 37 °C na jedną godzinę lub do momentu wyrównania temperatury. W celu przygotowania do obróbki Ben Nase, kolejnym krokiem jest potraktowanie płuc Ben Nase.

Aby usunąć pozostałości DNA z każdego płuca, najpierw napełnij jedną strzykawki o pojemności 10 ml samym podgrzanym buforem Ben Nase, a drugą strzykawką o pojemności 10 ml roztworem Ben Nase o stężeniu 90 units per milliliter rozcieńczonym w buforze Ben Nase. Zatrzymaj perfuzję płuc.

Następnie napompuj drogi oddechowe buforem Ben Nase, unikając wstrzykiwania powietrza do płuca. Pozostaw płuco do opróżnienia z powietrza na jedną minutę. Następnie napompuj płuco roztworem Ben Nase.

Ponownie, uważając, aby nie wprowadzić powietrza do płuc po ich napompowaniu za pomocą Ben Nase. Pozostawić płuca bez perfuzji i wentylacji w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę. Po upływie godziny wznowić perfuzję przy użyciu PBS z dodatkiem 10%FBS oraz 10% penicyliny i streptomycyny, który znajduje się już w bioreaktorze, i kontynuować perfuzję przez noc aż do następnego dnia.

Po płukaniu i sterylizacji długi rusztowanie z macierzy zewnątrzkomórkowej można przygotować do ponownego zasiedlenia komórkami. Roztwór P-B-S-F-B-S benzo należy zastąpić 250 mililitrami pożywki hodowlanej i przeprowadzić perfuzję przez co najmniej jedną godzinę przed wprowadzeniem komórek, a bezpośrednio przed wysianiem komórek zastąpić ją świeżą pożywką hodowlaną.

Wielu źródeł komórek można użyć do rekanalizacji organów. W niniejszym materiale zaprezentowane zostanie zasiedlanie z wykorzystaniem populacji komórek nabłonkowych. Najpierw należy przygotować strzykawkę zawierającą 15 milliliters zawiesiny komórek pożądanej populacji komórek nabłonkowych.

Następnie należy napełnić zbiornik dróg oddechowych 80 mililitrami pożywki hodowlanej i upewnić się, że wszystkie linie wentylacyjne są wolne od powietrza. Potem bioreaktor należy umieścić w inkubatorze do hodowli tkanek w temperaturze 37 stopni Celsjusza i podłączyć pompę strzykawkową do wentylacji. Komórki należy wprowadzić do płuc za pomocą pojedynczego szybkiego bolusa, wstrzykując 15 mililitrów zawiesiny komórkowej do kaniuli tchawiczej.

Upewnij się, że filtry powietrza w głównym bioreaktorze są zamknięte. Następnie niezwłocznie rozpocznij pojedynczy, powolny cykl odsysania, używając pompy strzykawkowej do pobrania 60 ml powietrza z głównego bioreaktora z prędkością 3 ml na minutę. Proces ten potrwa około 20 minut.

Następnie pozostaw płuca w stanie spoczynku przez około 18 godzin. Rozpocznij powolną perfuzję naczyniową z prędkością około 0,5 milliliters per minute. Podczas hodowli organów perfuzję przeprowadza się zazwyczaj z prędkością od one do three milliliters per minute.

Podczas hodowli nabłonkowej z użyciem pompy rolkowej wentylację zapewnia się zazwyczaj z ciągłą częstotliwością jednego oddechu na minutę i objętością oddechową od 5 do 10 ml. Przy zastosowaniu pompy strzykawkowej powietrze jest cyklicznie odsysane i wstrzykiwane do bioreaktora, aby symulować oddychanie poprzez naprzemienne wytwarzanie podciśnienia i ciśnienia atmosferycznego wewnątrz głównej komory. Ze względu na konieczność utrzymania szczelności bioreaktora podczas wentylacji, proces ten należy codziennie przerywać w celu wymiany powietrza w głównej komorze.

Dodatkowo pożywkę należy wymieniać mniej więcej co trzy do czterech dni. Podczas hodowli nabłonka płucnego i śródbłonka naczyniowego przy każdym wymianie należy zastąpić około połowy całkowitej objętości. W rusztowaniu zamontowanym w bioreaktorze jesteśmy w stanie wytworzyć tkankę płucną zdolną do uczestnictwa w wymianie gazowej przez krótkie odstępy czasu.

W celu porównania z barwieniem H&E zdecelularyzowanego płuca szczura przedstawiono tutaj standardowe barwienie hematoksyliną i eozyną natywnego płuca szczura. Końcowa zdecelularyzowana macierz pozakomórkowa powinna być całkowicie pozbawiona materiałów komórkowych i zachowywać makroskopowe, mikroskopowe oraz ultrastrukturalne cechy natywnego płuca. Barwienie H&E umożliwi wizualizację wszelkich pozostałości DNA przylegających do rusztowania w wyniku niewystarczającej decelularyzacji lub płukania, co pozwoli na ustalenie optymalnych warunków dla zasiewu komórek i późniejszej hodowli płuca.

Bioreaktor powinien zapewnić równomierny rozkład komórek we wszystkich pięciu płatach płuca oraz pokrycie rusztowania macierzy zewnątrzkomórkowej na poziomie około 70%. Przedstawione obrazy porównują natywne płuco z płuciem repopulowanym po barwieniu immunofluorescencyjnym. W odniesieniu do kluczowych markerów płuc, hodowana populacja komórek jest pozytywna w kierunku białka sekrecyjnego komórek Clary (secretory protein C) oraz akwaporyny 5.

Markery zainteresowania są pokazane na czerwono, a jądra barwione DAPI na niebiesko we wszystkich panelach. Po opanowaniu tej procedury, od decelularyzacji do resekcji, można ją przeprowadzić w ciągu czterech do pięciu dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.