Zmodyfikowany test oparty na mysich embrionalnych komórkach macierzystych do ilościowego określania wydajności indukcji kardiogennej

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest zidentyfikowanie kluczowej regulacji czasowej niezbędnej do różnicowania kardiomiocytów w embrionalnych komórkach macierzystych myszy. Osiąga się to poprzez utworzenie w pierwszym etapie ciałek embrionalnych (EB) w płytce 96-dołkowej z okrągłym dnem, aby zstandaryzować proces tworzenia EB. W drugim kroku do EB dodaje się modulatory białkowe lub chemiczne w określonym przebiegu czasowym, co pozwala na czasową kontrolę badanych szlaków.

Następnie liczbę bijących EBS określa się manualnie, aby ustalić wydajność indukcji różnych schematów modulacji sygnału. Uzyskane wyniki wykazują wymagania czasowe istotnych szlaków sygnalizacyjnych dla różnicowania kardiomiocytów na podstawie procentu powstałych bijących EBS oraz potwierdzenia z wykorzystaniem metody wiszącej kropli. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak wiszące krople, jest to, że standaryzuje i upraszcza ona pracochłonną procedurę oraz umożliwia bezpośredni odczyt do kwantyfikacji.

Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biologii komórek macierzystych, takie jak identyfikacja niezbędnych szlaków sygnalizacyjnych kierujących różnicowaniem w stronę pożądanego typu komórek. Aby rozpocząć tę procedurę, należy hodować embrionalne komórki macierzyste myszy w 10 centymetrowych płytkach hodowlanych w pożywce do komórek ES myszy uzupełnionej o czynnik hamujący białaczkę (leukemia inhibitory factor). Komórki ES są gotowe do użycia, gdy osiągną 50 do 70% konfluencji.

Usunąć pożywkę ES i raz przepłukać komórki pięcioma mililitrami sterylnego PBS. Do każdej płytki dodać dwa mililitry 0,05% trypsyny EDTA i inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez trzy do pięciu minut. Następnie zneutralizować działanie trypsyny EDTA, dodając trzy mililitry pożywki ES na płytkę, a następnie przenieść komórki do probówki wirówkowej o pojemności 50 mililitrów.

Wirować z prędkością 1000 obr./min przez trzy minuty. Po wirowaniu usunąć nadsącz i zawiesić osad komórkowy w odpowiedniej ilości medium EB. Policzyć komórki, a następnie rozcieńczyć zawiesinę do stężenia 5 × 10³ komórek/ml.

Do pożywki EB, używając pipety wielokanałowej, dodaj 100 µL pożywki EB zawierającej komórki do każdego dołka 96-dołkowej mikropłytki z okrągłym dnem. Liczba wymaganych płytek 96-dołkowych będzie zależeć od liczby warunków i punktów czasowych eksperymentu. Umieść 96-dołkowe mikropłytki z okrągłym dnem w inkubatorze z wilgotnym środowiskiem w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide, aby zidentyfikować krytyczne okna czasowe kluczowych szlaków sygnalizacyjnych dla kardiogenezy.

Do komórek ES dodaje się modulatory specyficznych szlaków sygnalizacyjnych. Do płytek 96-dołkowych o okrągłym dnie dodaje się modulator sygnalizacji rozcieńczony w pożywce, wprowadzając go do każdego dołka w różnych punktach czasowych. Połowę dołków w każdej płytce 96-dołkowej wykorzystuje się dla każdego początkowego punktu czasowego traktowania.

Kontrolę nośnikiem dodaje się do pozostałych 48 studni dla każdego punktu czasowego. W różnych punktach końcowych wypłukujemy modulatory sygnałowe z każdej studni poprzez wymianę medium; podczas tej czynności należy zachować szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić ciał embrionalnych. W różnych punktach czasowych zakończenia eksperymentu wypłukujemy modulatory, wymieniając medium EB w studniach. Płytkę 96-dołkową przechylamy pod kątem około 10 stopni i ostrożnie odsysamy medium ze studni za pomocą pipety wielokanałowej.

Następnie, w przypadku każdej inkubacji trwającej dłużej niż 48 godzin, do każdego dołka należy dodać ponownie pożywkę EB bez modulatora. Pożywkę EB uzupełnioną o świeże modulatory należy wymieniać co dwa dni aż do osiągnięcia pożądanego czasu zakończenia eksperymentu. W siódmej dobie po indukcji EB, przeprowadzonej poprzez przeniesienie komórek ES na płytki 96-dołkowe, należy ocenić stopień kurczenia się EB pod mikroskopem.

Dołki z kurczących się EBS należy oznaczyć jako pozytywne, aby obliczyć procent kurczących się EBS dla każdego z różnych przebiegów czasowych traktowania. Okna czasowe sygnalizacji kardiogenezy zidentyfikowane w eksperymentach na płytkach 96-dołkowych można zweryfikować w EBS utworzonych z wiszących kropli, aby stworzyć wiszące krople EB. W pierwszej kolejności należy przygotować szalki Petriego, dodając od trzech do czterech mililitrów PBS, aby zapobiec późniejszej aberracji kropli.

Następnie zawiesinę komórek ES przygotowaną w końcowym zagęszczeniu 2,5 × 10⁴ komórek/ml przelewa się do szalki bakteriologicznej w celu łatwiejszego dostępu. Za pomocą pipety wielokanałowej nanosi się krople komórek ES o objętości 20 µL na odwrócone pokrywki szalek Petriego. Należy dopilnować, aby poszczególne krople nie stykały się ze sobą.

Zazwyczaj na jednej pokrywce można zmieścić do 80 kropli. Następnie nakłada się pokrywkę z powrotem na szalkę Petriego zawierającą PBS i inkubuje przez 48 godzin w inkubatorze w temperaturze 37°C i 5% carbon dioxide, aby umożliwić formowanie się EB. Po 48 godzinach powstałe EB z wiszących kropli z każdej pokrywki spłukuje się trzema mililitrami medium do EB.

Przenieś dwa wieczka z EBS do nowej szalki Petriego. Inkubuj szalkę Petriego przez cztery dni w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide. W czwartym dniu przenieś EBS w zawiesinie na sześciodołkowe płytki pokryte 0,2% Gelatin w warunkach ogólnych. Do każdego dołka przenosi się 30 EBS. Inkubuj modulatory sygnalizacji przez okres określony na podstawie eksperymentów na płytkach 96-dołkowych, siedem dni po przygotowaniu kropli wiszących.

Obserwuj EBS pod mikroskopem w celu stwierdzenia skurczów EB; komórki ES hodowane w dołkach o okrągłym dnie płytki 96-dołkowej tworzą EBS, co pokazano na tym reprezentatywnym obrazie EB uformowanego w czwartym dniu. Krytyczne punkty czasowe dla kardiogenezy ES to okna czasowe, w których występuje najwyższy odsetek kurczących się EBS poddanych działaniu modulatorów sygnalizacji w porównaniu z kontrolą nośnikiem. Przedstawiono tutaj spontanicznie kurczące się ognisko kardiomiocytów powstałe z komórek ES traktowanych morfiną dorsalną w 10. dniu różnicowania na płytce mikrotitracyjnej 96-dołkowej.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak efektywnie identyfikować krytyczną regulację czasową oraz okna kluczowych szlaków sygnalizacyjnych w kardiogenezie komórek ES.