Chromatografia powinowactwa oparta na pęcherzykach lipidowych z wykorzystaniem magnetycznego sortowania komórek (LIMACS): nowatorska metoda analizy oddziaływań białko-lipid

Niniejszy eksperyment został zaprojektowany w celu identyfikacji białek wiążących lipidy oraz analizy oddziaływań białko-lipid w zdefiniowanym środowisku błonowym z liposomów. Białka z homogenatu komórkowego inkubuje się ze świeżo przygotowanymi pęcherzykami lipidowymi z fosfatydyloseryny i ceramidu. Następnie do mieszaniny reakcyjnej dodaje się magnetyczne kulki sprzężone z przeciwciałem anty-V w celu zakotwiczenia białek związanych z pęcherzykami lipidowymi na kulkach magnetycznych. Następnie pęcherzyki lipidowe z białkami są oczyszczane za pomocą magnetycznego sortowania komórek (MACS).

Aby zidentyfikować białka wiążące lipidy wykazane w wynikach, należy zastosować elektroforezę SDS-PAGE i Western blotting w celu wykazania oczyszczania endogennej i rekombinowanej atypowej PKC oraz specyficznej domeny wiążącej ceramidy wykazującej ekspresję w komórkach MDCK. Główną zaletą tej nowej techniki w stosunku do istniejących metod, takich jak ELISA czy spektroskopia rezonansu plazmonowego w badaniu wiązań powierzchniowych, jest fakt, że oddziaływanie białko-lipid zachodzi w środowisku przypominającym błonę komórkową, a wiążące białka mogą zostać oczyszczone i poddane analizie. Zastosowania tej techniki obejmują terapię i diagnostykę chorób związanych z lipidami, ponieważ w tych schorzeniach fizjologiczne oddziaływanie białko-lipid jest zaburzone.

W przypadku niektórych z tych chorób białkowe cele nie są nawet znane i muszą zostać zidentyfikowane. Aby zaprojektować terapię opartą na lipidach, należy rozpocząć od przygotowania SLs lipidowych z wysuszonej mieszaniny równomolowych ilości fosfatydyloseryny i ceramidu C16 w 100 µL buforu sical. Po dodaniu 300 µL buforu sical, uzupełnionego o 0,1 mM chlorku manganu, poddać próbki sonikacji przez jedną godzinę. Następnie odwiruj próbki przy 12 000 ×g przez 20 minut w temperaturze 4 °C, a następnie resuspenduj osad dużych pęcherzyków lipidowych w 100 µL buforu sical. Dodaj 1 nM fluorescencyjnego barwnika vibrant cm DII i inkubuj w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę, aby ułatwić wizualizację frakcji SLE po separacji magnetycznej. Odzyskaj różowy osad fosfatydyloseryny i ceramidu C16 w postaci SLs zabarwionych barwnikiem vibrant cm dai poprzez wirowanie, a następnie resuspenduj w 100 µL buforu TRIS.

Następnie, aby przygotować lizat komórkowy wolny od detergentów, poddaj komórki sonikacji w 300 µL hipertonicznego buforu 10 mM Tris-HCl zawierającego inhibitory proteaz i fosfataz, a następnie odwiruj próbkę. Aby usunąć szczątki błonowe, dodaj teraz klarowny lizat komórkowy do zawiesiny fizycznej lipidów i inkubuj mieszaninę przez dwie godziny w temperaturze 4 °C. Ponieważ lizaty komórkowe mogą zawierać endogenne błony z fosfoerytryną, zaleca się oczyszczenie lizatu z tych błon poprzez dodatkowe etapy wirowania.

Uzupełnić mieszaninę reakcyjną o 20 µL buforu wiążącego XNV oraz 50 µL roztworu zawierającego kule magnetyczne sprzężone z XNV, inkubować przez jedną godzinę w temperaturze 4 °C, a następnie przeprowadzić magnetyczną separację komórek (MACS) zgodnie z protokołem producenta. Następnie monitorować fluorescencję vibrant CM DII w frakcjach przepływowych i elowanych przy użyciu mikroplatejkowego czytnika fluorescencji, aby określić obecność i ilość lipidów w teście konkurencji przeciwciał. Aby zweryfikować swoistość reakcji wiązania A PKC z pęcherzykami ceramidofosforyno-serynowymi, inkubować 1 µg przeciwciała królika poliklonalnego anty-P KC Zeta z lizatem komórkowym przez jedną godzinę w temperaturze 4 °C, a następnie inkubować z pęcherzykami lipidowymi.

Kontynuuj analizę za pomocą elektroforezy SDS-PAGE oraz immunoblottingu w celu zbadania wiązania białek do fosfoserynozyny ceramidowej w eluatach maksymalnych podczas in vitro rekonstrukcji kompleksu polarności białek lipidowych; rozpocznij od przygotowania różowego osadu barwionych vibrant cm DII pęcherzyków fosfoserynozyny ceramidowej, zgodnie z wcześniejszym opisem, i resuspender pęcherzyki w 100 µL buforu tri, uzupełnionego o 100 µM gamma S GT P, 1 mM GDP oraz kombinację rekombinowanych białek zainteresowania. Następnie inkubuj reakcję w temperaturze 4 °C przez trzy godziny. Kolejnie dodaj 5 µL 20-krotnego roztworu zapasowego buforu X in V oraz 50 µL kulek magnetycznych sprzężonych z X in V.

Inkubować mieszaninę przy łagodnym mieszaniu przez kolejne 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusa. Kontynuować magnetyczną aktywację sortowania komórek NX NV zgodnie z protokołem producenta, aby ułatwić wytrącanie. Uzupełnić frakcję elucyjną o 10 µg czystej albuminy e.

Skoncentruj białka poprzez wytrącanie metodą weyl flue. Faza dolna składa się z chloroformu i metanolu z wzbogaconym vibrant cm dii. Brązowa interfaza zawiera kulki magnetyczne i wytrącone białko.

Ilościowo oznacz pęcherzyki lipidowe poprzez detekcję intensywnie różowego barwnika cm dii w organicznej fazie chloroformowo-metanolowej w reakcji weyl flu. Użyj równych ilości pęcherzyków lipidowych, aby znormalizować ilość białka pomiędzy próbkami, a następnie przeprowadź analizę metodą SDS-PAGE oraz immunoblotting.

Lizat komórek MDCK pozbawiony detergentów, wykazujący ekspresję pełnowymiarowego białka PKC Zetta z końcem C połączonym z zielonym białkiem fluorescencyjnym lub domeną wiążącą ceramid. Koniec C białka PKC Zetta inkubowano z fosfoseryną.

Po elucji z kolumny max, pęcherzyki ceramidowe oraz białka przeanalizowano za pomocą immunoblottingu. Fragment wiążący ceramid C 20 Zeta, EGFP oraz pełna długość P KC Zeta zostały odzyskane z eluatu kolumny max, co jest zgodne ze specyficznością i skutecznością procedury lyx. Negatywna kontrola EGFP, która nie wiązała się z fosforanowymi pęcherzykami ceramidowymi z Syrii, nie była wykrywalna w eluacie.

Gdy metodę Linx uzupełni się o inne techniki, takie jak SDS-PAGE, western blotting lub analizę proteomiczną, można uzyskać odpowiedzi na dodatkowe pytania, na przykład o to, które białka wchodzą w skład kompleksu białek wiążących lipidy. Po opracowaniu metody LabX otworzyła badaczom z dziedziny badań nad pojedynczymi lipidami drogę do eksploracji apoptozy indukowanej ceramidami oraz polarności komórek w komórkach macierzystych neuronów i komórkach nabłonkowych.