Wysokoprzepustowy pomiar i klasyfikacja fosforu organicznego w próbkach środowiskowych

Ogólnym celem niniejszej procedury jest klasyfikacja enzymatycznie hydrolizowanego fosforu organicznego w ekstraktach z próbek gleby lub obornika. Osiąga się to poprzez uprzednią ekstrakcję próbek roztworem wodorotlenku sodu i EDTA oraz regulację pH ekstraktów. Następnie regulowane ekstrakty inkubuje się z dwoma różnymi roztworami enzymów.

Ostatnim krokiem na płytce 96-dołkowej jest pomiar ortofosforanu uwalnianego przez enzym przy użyciu kolorymetrii błękitu molibdenowego. W rezultacie większość rodzimych form fosforu w postaci monoestrów i diestrów ortofosforanu w próbkach gleby lub obornika może zostać sklasyfikowana na podstawie różnicowego uwalniania ortofosforanu metodą hydrolizy enzymatycznej. Metodę tę można tanio przeprowadzić w każdym standardowym laboratorium.

Główną zaletą tej metody w porównaniu z istniejącymi technikami, takimi jak spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego fosforu 31, jest możliwość pomiaru potencjału natywnych enzymów glebowych do uwalniania ortofosforanu z organicznych związków grochu w przyszłości. W związku z tym dane uzyskane tą metodą mogą pomóc w prognozowaniu żyzności gleby lub potencjału gleby do uwalniania szkodliwych ilości ortofosforanu dostępnego dla alg. Do 2 g mokrej lub wysuszonej próbki w 50 ml probówce stożkowej należy dodać 30 ml 0,25 M roztworu wodorotlenku sodu.

Inkubować z wytrząsaniem przez 16 godzin w temperaturze pokojowej. Próbki wirować przy 3000 ×g przez 30 minut, a następnie przenieść 100 µL do probówki do mikrowirowania o pojemności 1,5 mL zawierającej wcześniej bufor octanowy. Skorygowana próbka ma całkowitą objętość 1 mL i pH 5,0.

Przygotuj dwa roztwory zapasowe zawierające 0,5 jednostki na mililitr fosfatazy kwaśnej w 10 mililitrach świeżo przygotowanego 0,1 molowego octanu sodu o pH 5. Następnie dodaj zrekonstytuowaną liofilizowaną nukleazę NP1 z Penicillium Citrin do jednej z probówek z 10 mililitrami zapasu fosfatazy kwaśnej do końcowego stężenia 2,5 jednostki NP1 na mililitr; wymieszaj delikatnie, odwracając kilka razy probówkę, a następnie odwiruj oba roztwory enzymów przy 3000 ×g przez 30 minut. Aby sporządzić krzywą kalibracyjną, zacznij od dodania 1 mililitra 1 milimolarnego roztworu zapasowego fosforanu potasu do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 mililitra i wykonaj siedem seryjnych rozcieńczeń po 0,5 mililitra; odrzuć pierwszą probówkę, tak aby końcowy zakres rozcieńczeń wynosił od 20 µl do 0,625 nM fosforu.

Następnie przenieś standardy ORTOFOSFORANÓW do dwóch ostatnich kolumn na płytce, zaczynając od 0 nM ortofosforanu w rzędzie A i kończąc na 20 nM ortofosforanu w rzędzie H w trzech pierwszych studzienkach kolumny 10. Do kolejnych trzech studzienek kolumny 10 dodaj 40 µL roztworu enzymów PP oraz GP. Dodaj 40 µL roztworu jednego enzymu PP oraz GP oraz NP.

Na koniec do wszystkich sześciu studzienek dodaj 40 µL buforu octanowego o stężeniu 100 mM. Obecnie każda z pierwszych sześciu studzienek w kolumnie 10 powinna zawierać 80 µL roztworu. Do kolejnych dwóch studzienek dodaj 40 µL roztworu octanu sodu zawierającego 10 M glukozy i fosforanu oraz 40 µL roztworu enzymów PP i GP.

Dla każdej badanej próbki, po rozdzieleniu wszystkich próbek, nanieś 40 µL ekstraktów z próbek o dostosowanym pH do studni od pierwszej do dziewiątej w maksymalnie ośmiu rzędach. Używając pipety wielokanałowej, nanieś roztwór enzymu PP plus GP do kolumn od pierwszej do trzeciej, PP plus GP plus NP 1 do kolumn od czwartej do szóstej oraz 0,1 M bufor octanu sodu do kolumn od siódmej do dziewiątej. Wykonaj ten krok szybko, aby zapewnić wszystkim próbkom równoczesny czas inkubacji.

Przykryj płytkę 96-dołkową pokrywką i inkubuj próbki, roztwory enzymów, kontrole oraz krzywą kalibracyjną dokładnie przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C w wodzie dejonizowanej. Przygotuj po 50 mL z każdego z czterech roztworów zapasowych. Roztwór A musi być przygotowywany codziennie, szybko, przy użyciu pipety wielokanałowej.

Do wszystkich dołków płytki 96-dołkowej dodaj 25 µL SDS, 100 µL roztworu A, 20 µL roztworu B oraz 50 µL roztworu C. Przykryj płytkę i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Na koniec zmierz absorbancję przy 850 nm w dowolnym programowalnym czytniku płytek mikrodołkowych, wykorzystując aplikację arkusza kalkulacyjnego.

W pierwszej kolejności należy wykreślić krzywą kalibracyjną dla fosforu nieorganicznego, nanosząc na oś X wartości od 0 do 20 nanomoli fosforu, a na oś Y średnią z pomiarów absorbancji wykonanych w dubletach, następnie przeprowadzić regresję liniową i wyznaczyć równanie linii trendu. Następnie należy obliczyć poziom tła fosforu nieorganicznego poprzez wyciągnięcie średniej z wartości w kolumnach od pierwszej do trzeciej, a następnie zastosowanie krzywej kalibracyjnej do zestawu danych. Aby określić ilość fosforu pochodzącego z hydrolizy monoestrów fosforanowych, należy obliczyć średnią z wartości próbek wykonanych w triplikatach w kolumnach od czwartej do szóstej, a następnie odjąć od nich wartość dla roztworu enzymu kontrolnego oraz poziom tła fosforu nieorganicznego.

Następnie, aby obliczyć zawartość fosforu z fosforu zhydrolizowanego, DERs obliczają średnią z wartości próbek wykonanych w trzech powtórzeniach z kolumn od siedem do dziewięć i odejmują od niej wartość roztworu enzymu kontrolnego oraz tło nieorganicznego fosforu i fosforu z zhydrolizowanego monoestru z kolumn od czterech do sześciu. Typowa płytka 96-dołkowa przedstawia wyniki dla ośmiu próbek oraz krzywą kalibracyjną. Kontrole znajdują się w kolumnie 10.

Wzrost intensywności koloru między kolumnami pierwszą a trzecią wynika z obecności zhydrolizowanych związków fosforu z grupy monoestrów, natomiast między kolumnami czwartą a szóstą oraz siódmą a dziewiątą wynika on z obecności zhydrolizowanych związków fosforu z grupy diaestrów. W niniejszej pracy zastosowano metodę wysokoprzepustowej hydrolizy enzymatycznej w celu pomyślnej analizy rozkładu klas fosforu w ekstraktach z próbki gleby z Vermont, przygotowanych w 0,25 molarnym wodorotlenku sodu i 0,05 molarnym EDTA. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat pomiaru natywnych ortofosforanów oraz związków monoestrów i diaestrów fosforu w ekstraktach z gleby lub obornika przy użyciu hydrolizy enzymatycznej.

Ta technika może pomóc utorować drogę badaczom z dziedziny chemii środowiska i gospodarki składnikami odżywczymi w badaniu zachowania organicznego P w systemach glebowych lub nawozowych.