Charakterystyka lotnych związków bakteryjnych z wykorzystaniem spektrometrii mas z wtórną jonizacją przez elektroryzację (SESI-MS)

Wtórna jonizacja z rozpylaniem elektrostatycznym, spektrometria mas lub CS EMS umożliwia analizę lotnych związków bakteryjnych bez konieczności wstępnego przygotowania próbki. Przestrzeń nad kulturą bakteryjną jest wypierana przez dwutlenek węgla do komory reakcyjnej cssi. Przechodząc przez komorę reakcyjną SSI, substancje lotne przechodzą przez chmurę rozpylania elektrostatycznego i ulegają jonizacji.

Po jonizacji lotne związki są wprowadzane do spektrometru mas w celu analizy. Nadmiar gazu nośnego oraz nieaktywne lotne związki bakteryjne przechodzą przez filtr 0,22 mikrona, aby usunąć wszelkie czynniki bakteryjne, co stanowi dodatkowy środek ochrony, a następnie są odprowadzane do dygestorium. W rezultacie protokół CSI MS pozwala na uzyskanie odcisków palców lotnych związków bakteryjnych w ciągu kilku minut.

Przewidujemy, że technologia ta mogłaby znaleźć zastosowanie w wielu obszarach, w tym w analizie wydychanego powietrza pod kątem chorób zakaźnych, a nawet w systemach żywnościowych, gdzie moglibyśmy szybko wykrywać patogeny znajdujące się na żywności lub w niej. Technika ta oferuje kilka głównych zalet w stosunku do istniejących metod, takich jak GCMS, sift, MS oraz PT, RM S; po pierwsze, substancje lotne nie wymagają żadnego przygotowania przed analizą.

Po drugie, możliwe jest fragmentowanie określonych jonów w mieszaninie lotnej, co ułatwia identyfikację związków. Po trzecie, metoda ta jest szybka. Zazwyczaj zajmuje ona mniej niż pięć minut.

Aby przeanalizować każdą próbkę, należy wybrać odpowiednie naczynie do hodowli, biorąc pod uwagę wymagania wzrostowe danego gatunku, a także efektywny transport substancji lotnych do spektrometru mas. W tej demonstracji zastosowano standardowe butelki do pożywek o pojemności 100 mililitrów. Lotne związki bakteryjne są transportowane do spektrometru mas za pomocą strumienia gazu nośnego w celu zestawienia układu nośnego.

Linie gazowe dopasowuje się do butelek hodowlanych z nakrętkami gwintowanymi posiadającymi co najmniej dwa porty luer. Przed rozpoczęciem hodowli próbek należy wprowadzić linie dopływu i odpływu gazu przez porty luer oraz zaślepić wszystkie pozostałe porty. Naczynia należy poddać nadciśnieniu i zanurzyć w wodzie w celu sprawdzenia szczelności.

Wycieki gazu są główną przyczyną nietypowych wyników w postaci słabych lub nieobecnych sygnałów jonów lotnych pojawiających się w ciągu nocy. Hodowle e coli, K 12 oraz pseudomonas aerogen, PAO one w podłożu LB Lennox, przygotowując dwie repliki biologiczne dla każdego gatunku.

Przygotuj dziewięć sterylnych butelek hodowlanych zawierających 50 ml LB Lennox oraz jedną niezaszczepioną butelkę, która będzie służyć jako próbka ślepa. Zaszczep każdą kulturę nocną do dwóch butelek z próbką, tworząc powtórzenia techniczne. Inkubuj kultury oraz próbkę ślepą przez 24 godziny w temperaturze 37 °C. Ponieważ system CEMS jest zaprojektowany specjalnie do pobierania próbek substancji lotnych, ogranicz stosowanie pachnących produktów do higieny osobistej przed szczelnym podłączeniem instrumentu.

Należy zakryć wszystkie lotne odczynniki chemiczne w laboratorium i w miarę możliwości ograniczyć ruchy powietrza podczas testowania, aby zapobiec zanieczyszczeniu instrumentu oraz linii przesyłu gazu. W przypadku stosowania żywych czynników biologicznych, w linii gazu nośnego należy zainstalować filtry o odpowiedniej wielkości porów. Filtry te nie będą zakłócać transportu substancji lotnych do komory reakcyjnej sesi, jednak mogą nieznacznie wpłynąć na wydajność przesyłu aerozolu.

Aby zweryfikować, że zasilanie napięciem jest wyłączone, a system jest rozładowany elektrycznie, należy sprawdzić lampki kontrolne zasilacza napięcia. Upewnić się, że multimetr wskazuje wartość zero, a następnie uziemić przewody elektryczne. W tym momencie należy wprowadzić roztwór do elektrosprayu przeznaczony do analizy.

W trybie jonów dodatnich stosujemy roztwór do elektrorozpylania składający się z 0,1% kwasu mrówkowego, 5% metanolu i 94,9% wody. Aby uzyskać optymalną intensywność i stabilność sygnału, należy włączyć gaz nośny w postaci dwutlenku węgla i ustawić przepływ na 2 l/min. Należy przyłożyć ciśnienie do zbiornika z roztworem do elektrorozpylania, aby rozpocząć podawanie roztworu do komory reakcyjnej z prędkością przepływu 5 nl/s. Następnie należy włączyć zasilacz i ustawić napięcie na 2,5 kV.

Przyłożone napięcie wpływa na intensywność sygnału jonowego oraz stabilność stożka Taylora w rozpylaniu elektrostatycznym. Dla naszego systemu napięcia od dwóch do pięciu kilowoltów zapewniają najlepsze wyniki w trybie jonów dodatnich. Należy zachować ostrożność, ponieważ w tym momencie metalowe powierzchnie źródła jonizacji mogą wywołać niebezpieczny wstrząs elektryczny. Teraz należy skonfigurować metodę strojenia do monitorowania widma SEMS.

Odznacz pole wyboru wielokanałowego analizatora widm (multiple channel acquisition lub MCA). Ustaw czas akwizycji na 10 do 15 minut i rozpocznij zbieranie danych. Obserwuj widma tła gazu nośnego i dokonuj precyzyjnych korekt przyłożonego napięcia, aby uzyskać stabilny całkowity chromatogram jonowy oraz powtarzalne skany.

Kontynuuj zbieranie widm oraz A TIC przez pięć minut, aby upewnić się, że instrument jest ustabilizowany i zabezpieczony. Wprowadź parametry akwizycji odpowiednie dla Twojego eksperymentu. Zarejestruj widmo tła gazu nośnego do przyszłych eksperymentów.

Aby zebrać widmo tła. Przekieruj przepływ gazu nośnego przez linie obejścia, a następnie podłącz próbkę ślepą, przy zamkniętych zaworach, do linii przesyłowych urządzenia. Otwórz zawory do butelki z próbką i zamknij zawory linii obejścia.

Aby uzyskać powtarzalne widma, należy pozwolić systemowi na wyrównanie parametrów przez 30 sekund, podczas których stabilizuje się wilgotność w komorze reakcyjnej. Aby upewnić się, że system osiągnął stan równowagi, należy monitorować TIC, który będzie się zmieniać w okresie wyrównywania, a następnie ustabilizuje się.

Po ustabilizowaniu systemu rozpocznij pomiar widma. Po zebraniu widma usuń butelkę z próbką, najpierw otwierając linie obejścia gazu nośnego, a następnie zamykając zawory próbkowania.

I na koniec, wyjęcie butelki z próbką. Przeplucz system gazem nośnym przez dwie do czterech minut, aby usunąć wilgoć i zaabsorbowane substancje lotne z linii przesyłowych oraz zapobiec przenoszeniu zanieczyszczeń między próbkami. Zbierz dane dotyczące profilu lotnych związków dla każdej próbki bakteryjnej, okresowo pobierając dodatkowe widma tła, aby zapewnić dokładne odejmowanie tła.

Lotne odciski palców w trybie jonów dodatnich dla E. coli i P. aerogen, hodowanych tlenowo w pożywce LB Lennox przez 24 godziny w temperaturze 37 °C, są odmienne. W widmie lotnym E. coli dominuje indu przy stosunku masy do ładunku 118, natomiast widmo Pseudomonas aerogen zawiera większą różnorodność pików adduktów białkowych.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby zapisywać parametry instrumentalne zoptymalizowane dla danej analizy, takie jak przyłożone napięcie, skład roztworu do rozpylania elektrostatycznego oraz szybkość przepływu gazu nośnego. Należy również prowadzić dokumentację reprezentatywnych widm, aby umożliwić powtórzenie analiz w przyszłości. Należy pamiętać, że praca z bakteriami patogennymi oraz wysokim napięciem może być niezwykle niebezpieczna.

W związku z tym należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak ograniczenie dostępu do css CMS podczas eksperymentu. Teraz powinni Państwo być w stanie w sposób powtarzalny uzyskać widma CSS oraz EMS dla lotnych związków bakteryjnych w Państwa systemie. Powodzenia.