Immunocytochemia: ludzkie neuralne komórki macierzyste

Cześć, jestem Steve. Pracuję w laboratorium doktora Flanagana na Wydziale Patologii Uniwersytetu Kalifornijskiego w Irvine. A dzisiaj pokażę wam, jak przeprowadzić immunochemię ludzkich nerwowych komórek prekursorowych.

Protokół ten obejmuje umieszczanie komórek na powlekanych szkiełkach nakrywkowych oraz blokowanie i inkubację komórek w pierwotnym przeciwciałie przez noc, a następnie wykonanie kilku testów i nałożenie przeciwciała drugorzędowego w temperaturze pokojowej. I wreszcie, montaż pokrywy wsuwa się na loty mikroskopów. Zacznijmy.

Więc najpierw zamierzam umieścić trzy sterylne niemieckie szkiełka nakrywkowe o średnicy 12 milimetrów w 24-dołkowej płytce, aby pokryć je laminatem. Więc teraz mam moje szkiełka nakrywkowe na płytce i najpierw dodam roztwór polilizyny PDL, a następnie zamierzam inkubować suby okładki w PDL przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Więc teraz, po pięciu minutach, zamierzam usunąć PDL i nałożyć lamininę, a następnie zamierzam inkubować szkiełka nakrywkowe w laminacie przez co najmniej cztery godziny lub lepiej przez noc.

Tak więc inkubowałem płytkę przez noc w laminacie, a teraz zamierzam przepłukać szkiełka nakrywkowe PBS i płytką ludzkich nerwowych komórek prekursorowych, które już policzyłem. Więc właśnie usunąłem roztwory laminowane, a teraz zamierzam okiełznać szkiełka nakrywkowe za pomocą PBS. Więc teraz zamierzam usunąć PBS i założyć rozwiązanie multimedialne.

I w końcu jestem gotowy, aby zobaczyć komórki. Zobaczę więc komórki w ilości stu tysięcy komórek na promil, co oznacza, że na płytkę 24-dołkową dodam 50 000 komórek na studzienkę, ponieważ każda studzienka zawiera pół mililitra. Zamierzam więc przechylić płytkę z boku na bok, aby upewnić się, że komórki równomiernie rozkładają się na powierzchni szkiełka nakrywkowego.

A teraz zamierzam umieścić je w inkubatorze na co najmniej 24 godziny, aby mogły się uspokoić i rozłożyć do immunochemii. Tak więc komórki rosną od 24 godzin, a ja spojrzałem na nie i są przyczepione i ładnie rozłożone. Więc teraz zamierzam naprawić je z 4% wysokością przez pięć minut.

Ale najpierw zamierzam usunąć pożywkę i nie chcę, aby komórki wyschły. Więc zamierzam usunąć nośnik i dodać utrwalacz w tym samym czasie. Nazywa się to techniką oburęczną.

Więc teraz zamierzam inkubować komórki w utrwalaczu przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Minęło więc pięć minut. Zamierzam usunąć PFA i umieścić go w pojemniku na odpady PFA i dodać PBS w tym samym czasie, gdy usuwam PFA, aby komórki nie wyschły.

Więc zamierzam użyć jednej z tych plastikowych pipet ssących do podciągnięcia PFA i zamierzam ustawić minutnik na pięć minut. Tak więc, podczas gdy moje komórki są w praniu PBS, zamierzam przygotować rozwiązanie do wizualizacji trwałej ondulacji przy użyciu Triton X 100. Jest to detergent niejonowy i jest bardzo, bardzo lepki.

Dlatego ważne jest, aby poczekać, aż cały roztwór dostanie się i trafi do pipety. Więc zamierzam przygotować 0,3% roztwór w PBS, zamierzam dodać 10 milili PBS. A do tych 10 mililitrów PBS dodam 30 mikrolitrów tri next 100.

Więc zamierzam dodać 30 mikrolitrów tri następnie 100 do 10 mililitrów PBS. Więc dodam około 10 sekund, aby cały roztwór dostał się do końcówki. Więc ja, mam tutaj moje rozwiązanie do wykorzystania trwałej ondulacji.

Kładę go na rotatorze na 10 minut, a następnie wiruję, aby upewnić się, że lepki trykot całkowicie się rozpuścił. Więc teraz jestem gotowa do wykonania kroku wizualizacji trwałej ondulacji. Zamierzam więc spędzić pięć minut w temperaturze pokojowej.

Minęło więc pięć minut. Zamierzam teraz wykonać trzy pięciominutowe prania PBS, aby upewnić się, że zmyję cały tryton. Więc po raz kolejny zamierzam przestawić zegar na pięć minut.

Więc właśnie zakończyłem wszystkie etapy prania, więc jestem gotowy do wykonania kroku blokowania. Tak więc na etapie blokowania przygotowałem rozwiązanie 5%BSA w PBS. I tak jak w przypadku wszystkich prań, zamierzam usunąć PBS i jednocześnie dodać roztwór blokujący.

A etap blokowania będzie trwał godzinę w temperaturze pokojowej. Tak więc, podczas gdy moje komórki są w bloku, zamierzam przygotować płytkę do inkubacji przeciwciał pierwotnych. Zacznę od tej szklanej płytki i wytnę kawałek folii para, który jest mniej więcej tego rozmiaru.

Owinąłem to owinięciem i potrzebowałem trochę taśmy, więc będę potrzebował czterech kawałków taśmy. Więc po prostu przygotuję je wszystkie. Wezmę więc ten kawałek folii parafilmowej i wyprostuję go tak, aby powierzchnia była ładna i gładka.

A potem wezmę każdy koniec i przykleję go do tylnej części szklanej płyty. Więc teraz zamierzam pociągnąć to za drugi koniec, aby upewnić się, że powierzchnie są proste, a drugi koniec przykleję taśmą do tyłu. Więc teraz potrzebuję kolejnego kawałka folii dla par o tym samym rozmiarze co pierwsza.

I w zasadzie zamierzam zrobić to samo. Przykleiłem więc drugi kawałek folii parafilmowej na pierwszym, tak jak pierwszy, z wyjątkiem tego, że zostawiłem jeden koniec drugiego kawałka perfilu luźno, ponieważ zamierzam umieścić roztwór przeciwciała, a następnie poślizgnie się prąd na pierwszym kawałku. A potem położę na nim drugi kawałek, który robi kanapkę.

Ale w tej chwili zamierzam oznaczyć miejsce, w którym zamierzam umieścić roztwór przeciwciał i przykryć. Tak więc, komórki są w roztworze blokującym już od godziny, a ja zamierzam teraz nałożyć szkiełka nakrywkowe na kropelki przeciwciała pierwotnego do inkubacji przez noc. Więc zamierzam umieścić kroplę 35 mikrolitrów przeciwciała pierwszorzędowego i będę bardzo ostrożny, aby nie wydalić całego płynu, ponieważ może to spowodować powstanie pęcherzyków, a bąbelki mogą zakłócać wiązanie przeciwciała z antygenem.

Chcę więc starać się uniknąć pęcherzyków w kropli, wszystkich trzech kroplach przeciwciała pierwotnego, i jestem gotowy, aby umieścić osłonę, przykrywki z komórkami na tych kroplach. Więc to, co teraz zrobię, to wezmę kartkę nakrywkową. Więc najpierw przesunę szkiełko nakrywkowe na bok i spróbuję delikatnie je podnieść przy otwartej pęsetie.

Gdy tylko poczuję, że udało mi się uchwycić szkiełko nakrywkowe, zamknę się, aby powoli zamknąć pęsetę i delikatnie wyjąć szkiełko nakrywkowe z dołka. Tak więc komórki w tej chwili znajdują się na wierzchu szkiełka nakrywkowego. Więc to, co zamierzam zrobić, to odwrócić odwrócenie i delikatnie dotknąć kropli i powoli położyć ją na kropli, nie tworząc żadnych bąbelków.

Powtórzę więc tę samą procedurę z drugim i trzecim szkiełkiem okładkowym. Ostatnim krokiem jest umieszczenie drugiego kawałka folii para. Sposób, w jaki zamierzam to zrobić, polega na tym, że zamierzam odłożyć to jednym ruchem, w ten sposób.

Chcę starać się unikać poruszania się, przesuwania go z boku na bok. A na koniec zamierzam przymocować go do spodu płyty za pomocą kolejnego kawałka taśmy. A teraz w końcu komórki są gotowe do inkubacji w temperaturze czterech stopni przez noc i to jest koniec pierwszego dnia immunochemii.

To jest drugi dzień chemii immunologicznej i zamierzam umyć szkiełka nakrywkowe w PB S3 razy przez pięć minut. A potem zamierzam inkubować w przeciwciałach drugorzędowych przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Najpierw zamierzam przyciąć folię para, aby móc usunąć szkiełka nakrywkowe.

I zamierzam powoli podnieść górną część folii para, aby ślizgi okładki pozostały na dolnym kawałku folii do pielęgnacji. Usunąłem więc pierwszą sztukę i mam gotową płytkę z roztworem do mycia PBS. Więc zamierzam podnieść każdą zupę i umieścić ją w studzience, aby zmyć resztki pierwotnego przeciwciała, które nie przyczepiły się do epitopu.

Tak więc, aby podnieść szkiełko nakrywkowe, najpierw przytrzymam je w ten sposób żyletką i po prostu delikatnie spróbuję je podnieść. A ponieważ komórki są, mamy do czynienia z roztworem przeciwciał, zamierzam je obrócić tak, aby były teraz na wierzchu i wsunąć je do studzienki, aby nadal pozostały na wierzchu. I zamierzam powtórzyć procedurę dla pozostałych poślizgnięć mocy.

Będą więc myte przez pięć minut. Minęło więc pięć minut. Zamierzam wymienić rozwiązanie PBS.

Dodam matrycę do haków. Teraz zamierzam go inkubować przez pięć minut. Tak więc inkubacja haków jest zakończona, a teraz jestem gotowy do zamontowania osłon sos i przyjrzenia się im.

Więc najpierw zamierzam alk quad vector shield, który pomaga utrzymać fluorescencyjne dziesięciocentówki przed wybielaniem. Zamierzam, no cóż, najpierw oznaczę slajd numerami szkiełek nakrywkowych, a następnie umieszczę 10 mikrolitrów tarczy wektorowej. Tarcza wektorowa jest, jest olejem i jest naprawdę lepka, więc ważne jest również, aby trochę poczekać, aż wszystko dostanie się do końcówki.

Umieściłem więc osłonę wektorową na szkiełku mikroskopowym, a teraz jestem gotowy do nałożenia szkiełek nakrywkowych na szkiełko mikroskopu. Więc to, co zamierzam najpierw zrobić, to wezmę szkiełko nakrywkowe i spłuczę tylną część szkiełka nakrywkowego wodą dejonizowaną, ponieważ jeśli tego nie zrobię, kiedy wyschnie, sól, która była w PBS, skrystalizuje i będzie zakłócać właściwości optyczne matryc fluorescencyjnych. Więc zamierzam to zrobić, mam gotową wodę dejonizowaną.

Podniosę więc szkiełko nakrywkowe i spłuczę jego tył wodą dejonizowaną. A potem dotknę blaszanej chusteczki, żeby ją wysuszyć. A potem zamierzam odwrócić to ponownie, tak aby strona komórki była odwrócona i schodziła w dół na szkiełko mikroskopu.

I tak jak poprzednio, zamierzam dotknąć kropli tarczy wektorowej i powoli ją opuścić, nie zatrzymując żadnych bąbelków. I zamierzam powtórzyć to samo, tę samą procedurę dla wszystkich przewracanych ładunków. A teraz spójrzmy.

To jest przykład tego, co możesz uzyskać po zrobieniu chemii immunologicznej i uzyskaniu zdjęć, zrobieniu nakładek i tym podobnych. Na tym zdjęciu widać komórki macierzyste neuro hipokampa wyizolowane z wgnieceń u myszy po urodzeniu. Dzisiaj pokazałem Wam, jak przeprowadzić immunochemię ludzkich neuronalnych komórek prekursorowych.

A jeśli zauważysz, ta technika pozwala zaoszczędzić ekspansywny odczynnik przeciwciała. Użyliśmy bardzo małej objętości przeciwciała pierwszorzędowego i drugorzędowego, umieszczając małą kroplę na perfilu i odwracając szkiełko nakrywkowe z komórkami na nim. Więc kontynuuj, zajmij się chemią immunoterapii i dziękuję za obserwowanie mnie.