Krzemowe mikroczipy do manipulowania oddziaływaniami międzykomórkowymi

Cześć, nazywam się Elliot Hu. Jestem stypendystą podoktorskim w laboratorium Tii tutaj, w Massachusetts Institute of Technology. Dzisiaj przygotujemy hodowle komórkowe na krzemowych chipach mikromechanicznych. Urządzenia te przypominają małe grzebienie, które zazębiają się ze sobą, co pozwala nam precyzyjnie manipulować oddziaływaniami między dwiema różnymi populacjami komórek.

Dzisiaj zbadamy interakcje między hepatocytami wątroby a wspierającymi komórkami zrębu. W szczególności fibroblasty 3T3 są hodowane na górnej powierzchni grzebieni, dzięki czemu poprzez przesuwanie zębów grzebienia można przemieszczać komórki i zmieniać ich rozmieszczenie przestrzenne. Każde urządzenie jest podzielone na dwie części, które zatrzaskują się w dwóch możliwych konfiguracjach.

Pierwsza z nich doprowadza do kontaktu obu populacji komórek. Druga rozdziela te populacje w niewielkim stopniu, tak aby komórki nie mogły się dotykać. W tym przypadku zapobiega się interakcjom kontaktowym, lecz zachowuje się interakcje poprzez wydzielane czynniki.

Zacznijmy od omówienia sposobu manipulowania elementami za pomocą pincet. Preferuję używanie zarówno większych pincet teflonowych, jak i mniejszych metalowych pincet z okrągłymi końcówkami. Za pomocą większej pincety można chwytać elementy za krawędzie w ten sposób; w przypadku większych części z ramionami należy zachować ostrożność, aby ich nie złamać, ponieważ są one bardzo delikatne.

Należy chwycić je z tyłu elementu w ten sposób. Za pomocą metalnej pęsety można sięgnąć do otworu i bezpośrednio wyciągnąć chipy. Większe elementy zmieszczą się w ściankach płytki 12-dołkowej, natomiast mniejsze elementy zmieszczą się w płytce 24-dołkowej lub mogą być zestawione z elementem większym.

W płytce 12-dołkowej zazwyczaj używam metalnej pęsety. Podczas manipulowania elementami w płytkach w celu ich połączenia, zazwyczaj najpierw umieszczam większy element w dołku i przesuwam go do jednej z krawędzi. Następnie pobieram pasującą część naprawczą i kładę ją po przeciwnej stronie dołka, a następnie dociskam oba elementy do siebie, wkładając dwie pęsety w każdy z otworów.

Teraz mogę po prostu zablokować części ze sobą, albo w konfiguracji z przerwą, albo w konfiguracji styku. Jeśli chcę rozdzielić części, przesuwam je do konfiguracji z przerwą, a następnie podnoszę pionowo, aby wyjąć element. Ponieważ urządzenia są wykonane z krzemu, muszą zostać pokryte odpowiednią warstwą, aby zapewnić właściwą adhezję komórek.

Prawdopodobnie otrzymają Państwo urządzenia już powlekane polistyrenem i poddane działaniu plazmy, dlatego przyjmiemy to jako nasz punkt wyjścia. Przede wszystkim użyjemy kolagenu do powlekania powierzchni, do której przyłączą się hepatocyty. Grzebienie do hepatocytów umieścimy w roztworze kolagenu o stężeniu 50 µg/ml i inkubujemy w temperaturze 37 °C przez 45 minut.

Z kolei grzebieni dla fibroblastów nie wymagają powlekania. Po inkubacji odsysamy roztwór kolagenu i płuczemy wodą. Teraz zablokujemy elementy ES razem w kontakcie z dopasowanymi częściami, aby stworzyć płaską powierzchnię do wysiewu komórek.

Najpierw napełnimy niektóre dołki 70% ethanol. Umieszczę parę w każdym dołku, a następnie zablokuję je ze sobą. Po zablokowaniu chcemy obejrzeć części pod mikroskopem, aby upewnić się, że są one współpłaszczyznowe.

Od czasu do czasu elementy mogą zostać zablokowane w niewłaściwej pozycji. Wówczas pod mikroskopem będzie widać, że znajdują się one w dwóch różnych płaszczyznach ogniskowania. W takim przypadku należy po prostu rozdzielić elementy i ponownie je złożyć. Po sprawdzeniu, czy wyrównanie jest prawidłowe, pozostawiamy elementy w etanolu przez pewien czas w celu sterylizacji.

Często działam w pośpiechu, dlatego namaczam tylko przez 10 minut. Po sterylizacji należy wypłukać pozostałości. Należy dokładnie odessać etanol i przemyć wodą, następnie ponownie odessać i przemyć wodą, a na koniec odessać wodę i zastąpić ją pożywką hodowlaną.

Przejdźmy teraz do wysiewania komórek na urządzenia. Zazwyczaj zawieszamy komórki w stężeniu 500 000 komórek na mililitr, a następnie za pomocą płytki 12-dołkowej pipetujemy jeden mililitr zawiesiny na każdą parę grzebieni. W tym przypadku wysialiśmy fibroblasty w stężeniu 500 000 komórek na mililitr w dwóch z dołków.

Podobnie przygotowaliśmy zawiesinę zawierającą 500 000 hepatocytów na dołek i zasialiśmy je w dwóch pozostałych dołkach. Przed inkubacją należy dokładnie wstrząsnąć komórkami, aby upewnić się, że są one równomiernie rozłożone. Ja zazwyczaj wstrząsam płytką trzy razy w pionie i trzy razy w poziomie, a następnie powtarzam ten cykl trzykrotnie.

Po wymieszaniu umieścimy próbkę w inkubatorze i pozostawimy komórki na 15 minut, po czym ponownie je wymieszamy. Po powtarzaniu mieszania co 15 minut przez jedną godzinę odessamy zawiesinę komórkową i dodamy nową zawiesinę komórek. Będziemy powtarzać tę czynność do uzyskania konfluencji warstwy komórek.

W przypadku fibroblastów zazwyczaj wymaga to jednego lub dwóch wysiewów. W przypadku hepatocytów może być potrzebnych od dwóch do czterech wysiewów. Aby uzyskać konfluentną monowarstwę, komórki wysiewa się z dość wysoką gęstością; wstrząsanie zapewnia równomierny rozkład komórek.

Po pierwszym wysiewaniu tworzy się rzadka warstwa komórek. Zauważmy, że komórki przyкрепiają się tylko do palców, które zostały pokryte polistyrenem i kolagenem. Po wysianiu świeżych komórek i inkubacji przez kolejną godzinę, ponownie z wstrząsaniem co 15 minut, warstwa komórek staje się gęstsza.

Po trzecim wysiewie uzyskaliśmy odpowiednią gęstość komórek; w tym momencie można przerwać proces, gdy komórki zostaną już wysiane na grzebienie. Następnie należy wprowadzić komórki w pożądaną konfigurację eksperymentalną. Urządzenia zostają teraz oddzielone od swoich części uzupełniających i inkubowane przez 24 godziny.

Po 24 godzinach komórki rozprzestrzeniły się, tworząc konfluencyjną monowarstwę na powierzchni grzebieni. Teraz chcemy stworzyć kokulturę. Grzebień z hepatocytami oraz grzebień z fibroblastami zostają przeniesione do tej samej studni i zablokowane razem w pożądanej konfiguracji początkowej.

Opcjonalnie. Po określonym czasie można zmienić konfigurację. Na przykład po 18 godzinach można przejść do konfiguracji z przerwą; części są umieszczane w tym samym miejscu i mocno dociskane do siebie, aż do osiągnięcia konfiguracji z przerwą, a następnie ponownie dociskane w celu powrotu do konfiguracji z przerwą.

Teraz usuniemy jeden grzebień. W dalszej części przejdziemy przez proces usuwania starej powłoki polistyrenowej, oczyszczania chipów, a następnie nakładania nowej powłoki polistyrenowej i przygotowania ich do hodowli komórkowej. Ponownie zaznaczamy, że poprzez usunięcie starej powłoki polistyrenowej i nałożenie nowej warstwy zapewniamy, aby żadne pozostałości z poprzedniego eksperymentu nie zakłóciły przebiegu nowego badania.

Po zakończeniu eksperymentu w pierwszej kolejności należy poddać komórki działaniu podchlorynu sodu, a następnie wypłukać grzebienie wodą. Przed umieszczeniem chipów w urządzeniu należy upewnić się, że są one całkowicie suche. Tutaj mamy kilka grzebieni, które pozostawiłam do wyschnięcia na powietrzu i sprawdzam, czy są one całkowicie suche.

Teraz przelejemy niewielką ilość do tej szklanej probówki. Użyjemy tutaj szklanej pipety, aby uniknąć jej rozpuszczenia. Halogen rozpuszcza plastik, dlatego nie możemy użyć typowej pipety polistyrenowej.

W porządku, to powinno wystarczyć. Teraz weźmiemy kilka tych części, umieścimy je w toluenie, a następnie włączymy wytrząsarkę w celu wymieszania i przykryjemy naczynie folią aluminiową, aby zapobiec odparowaniu toluenu. Po dwóch godzinach toluen powinien rozpuścić większość polistyrenu na grzebieniach, po czym możemy je wyciągnąć i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu.

Po płukaniu w Halloween części powinny być względnie wolne od polistyrenu i powinny być stosunkowo czyste. Muszą one być jednak ekstremalnie czyste, ponieważ w przeciwnym razie nowa warstwa polistyrenu nie zapewni dobrej adhezji. W przypadku niewystarczającej czystości polistyren ma tendencję do odwarstwiania się w trakcie eksperymentu, gdy komórki zaczynają na niego oddziaływać.

W tym kroku przeprowadzimy czyszczenie roztworem pirania. Umieściłem elementy w szklanym naczyniu, które teraz będziemy podgrzewać, ustawiając je na płycie grzejnej.

Oto kwas siarkowy i nadtlenek wodoru. Najpierw wleję kwas siarkowy, dbając o to, aby wszystkie fragmenty tkanki były całkowicie zanurzone w cieczy. Czasami mają one tendencję do wypływania na powierzchnię.

Ponieważ pracujemy z dość żrącymi chemikaliami, należy upewnić się, że używa się odpowiedniego sprzętu ochronnego. W tym przypadku mam na sobie rękawiczki nitrylowe. Teraz wlejemy nadtlenek wodoru do kwasu; należy zachować ostrożność, ponieważ jest to reakcja egzotermiczna.

Można zauważyć, że podczas reakcji wydziela się niewielka ilość dymu, jednak chcemy dostarczyć do układu energię, aby zwiększyć reaktywność. Dlatego teraz podgrzejemy go do 120°C; przy tej temperaturze można mieć pewność, że wszelkie pozostałości hodowli komórkowej zostaną całkowicie usunięte z chipów. Na tym etapie należy pozwolić reakcji przebiegać do końca, aż cały nadtlenek wodoru zostanie zużyty.

W tym momencie mieszanina przestanie bąblować. Reakcja trwa około pół godziny do całkowitego zakończenia. Po ustaniu powstawania pęcherzyków powietrza można wyłączyć płytę grzejną i pozwolić próbce ostygnąć.

Następnie przeniesiemy je do wody z BAK. Ponownie upewnijcie się, że używacie pęsety teflonowej, a nie metalowej; możecie po prostu podnieść próbki i je przenieść. Teraz opłuczemy je pod stałym strumieniem ddH₂O. Zazwyczaj pobieram wodę bezpośrednio z głównego zaworu i pozwalam jej płynąć przez co najmniej 10 minut.

W ten sposób wypłuczemy wszystkie pozostałości kwasu po mieleniu, trzymając próbkę pod strumieniem wody przez 10 minut. Kwas powinien zostać całkowicie usunięty z chipsów, a następnie będziemy je przechowywać pod wodą do momentu, aż będziemy gotowi do powlekania polistyrenem o masie cząsteczkowej 45 000, który otrzymaliśmy z firmy Sigma. Odważymy tutaj jego niewielką ilość.

Mamy 400 mg, które rozpuszczymy w toluenie w stężeniu 100 mg/ml. Toluen należy obchodzić się w dygestorium. Ponadto, ponieważ używamy toluenu do rozpuszczania polistyrenu, musimy upewnić się, że nie używamy żadnych naczyń laboratoryjnych wykonanych z polistyrenu.

Używamy probówki stożkowej z polipropylenu oraz pipety szklanej. Ponieważ dysponuję 400 mg polistyrenu, dodaję 4 mL toluenu. Następnie będziemy mieszać próbkę w wstrząsarku typu vortex przez pół godziny, aż polistyren się rozpuści. Będziemy teraz mieszać probówkę w wstrząsarku przy najniższej prędkości przez około 20 minut do pół godziny.

Teraz przymocuję probówkę do vortexa. Nie muszę trzymać jej przez cały czas. Po 20 do 30 minutach polistyren powinien zostać rozpuszczony i będziemy gotowi do powlekania.

Teraz naniesiemy polistyren metodą spin coatingu w naszym laboratorium. Nasza wirówka do nanoszenia warstw znajduje się w pomieszczeniu typu clean room. Dlatego musimy tutaj nosić czepek, gogle, fartuch, ochraniacze na buty i rękawiczki, choć w Państwa placówce może to wyglądać inaczej.

Zanim użyjemy tego uchwytu, chcę go zabezpieczyć przed polistyrenem. Dlatego pokryjemy go folią aluminiową, dbając o to, aby przylegała ona do powierzchni jak najpłaszczniej, by chip mógł ściśle do niej przylegać. W samym centrum zrobimy niewielki otwór, aby móc utrzymać chip za pomocą próżni.

Wirówkę ustawiono na 2 400 RPM i 30 sekund. Teraz możemy wziąć jeden z naszych chipów, umieścić go tak, aby środek chipu zakrywał otwór; podczas nakładania polistyrenu początkowo wyłączę próżnię, następnie włączę próżnię i rozpocznę wirowanie. W przypadku mniejszych części możemy nanieść nieco mniej niż 10 kropli.

W przypadku większych części należy zużyć nieco więcej niż 10 kropli polistyrenu. Następnie wirować próbkę przez 30 sekund przy 2 400 RPM. Teraz przeniesiemy chipy powleczone polistyrenem do piekarnika w temperaturze 120 °C. Jest to temperatura powyżej punktu przejścia szklistego polistyrenu.

W ten sposób powierzchnia zostanie przetopiona, aby ją nieco wygładzić, a plastik zostanie zagęszczony i utwardzony. Zazwyczaj pozostawiam go w piekarniku na całą noc. Proces ten trwa prawdopodobnie co najmniej kilka godzin.

Po całonocznym wypalaniu chipy są gotowe do obróbki plazmowej. Teraz poddamy polistyren działaniu plazmy tlenowej, co zmieni energię powierzchniową i sprawi, że białka i komórki będą lepiej do niego przylegać. Wkładamy zatem chipy do komory plazmowej i wypompowujemy powietrze, aby wytworzyć próżnię.

Odpowiednie ustawienia to 200 mTor próżni oraz moc 200 W przez jedną minutę w przepływie tlenu. Po odpompowaniu układu wprowadzamy tlen. Teraz możemy włączyć moc RF i wzbudzić plazmę na jedną minutę.

Kiedy plazma pracuje, emituje ona światło. Przypomina to żarówkę fluorescencyjną. Po jednej minucie ekspozycji na plazmę przywrócimy ciśnienie do poziomu atmosferycznego, a następnie będziemy mogli wyjąć elementy.

Teraz elementy są gotowe do powlekania białkiem i zasilania komórkami. Celem przy projektowaniu tego urządzenia było umożliwienie nam dynamicznego manipulowania mikroarchitekturą tkanki. Mikroorganizacja tkanki w organizmie, a konkretnie rozmieszczenie komórek względem siebie, ma kluczowe znaczenie dla określenia funkcji każdej poszczególnej komórki w hodowli laboratoryjnej.

Do niedawna nie byliśmy w stanie skutecznie tego replikować, jednak w ciągu ostatnich pięciu lub dziesięciu lat zaczęto stosować mikrostrukturyzację komórek na podłożu do hodowli tkankowych, co pozwala na umieszczenie komórek dokładnie tam, gdzie chcemy je mieć w płytce hodowlanej. Dzięki temu możliwe stało się odkrycie niektórych istotnych aspektów podstawowej biologii oddziaływań międzykomórkowych w skali mikro. Do tej pory nie byliśmy jednak w stanie robić tego w sposób dynamiczny.

Polega to na zmianie organizacji hodowli komórkowej w trakcie trwania eksperymentu. Jest to istotne, ponieważ w organizmie tkanka nie jest środowiskiem statycznym. Komórki przemieszczają się i reorganizują, co jest szczególnie widoczne podczas gojenia ran lub rozwoju.

Jednak nawet w normalnym narządzie w stanie homeostazy zachodzi wiele procesów transportu. Najtrudniejszym aspektem technicznym do opanowania jest sam sposób fizycznego manipulowania poszczególnymi elementami. Na początku pracy z tym układem można poczuć się onieśmielonym tym, jak delikatne są poszczególne części lub jak niewielkie ruchy są wymagane.

Sądzę jednak, że po krótkim treningu nie powinni Państwo mieć z tym większych problemów. W niektórych przypadkach, w których urządzenie to znajduje zastosowanie, na przykład w rozwoju embrionalnym, komórki wchodzą w kontakt z szeregiem różnych środowisk komórkowych podczas przemieszczania się przez poszczególne warstwy embrionalne. Znane jest to, że interakcje z każdą z tych warstw, zachodzące sekwencyjnie, napędzają procesy wzdłuż konkretnej ścieżki różnicowania.

Uważamy zatem, że tego rodzaju urządzenie może być przydatne w próbach odtworzenia tego typu zdarzeń w warunkach laboratoryjnych. Jednym z aspektów mikroorganizacji, który szczególnie chcieliśmy zbadać, była różnica między komunikacją komórkową poprzez oddziaływania kontaktowe, w których błony komórkowe mogą bezpośrednio się ze sobą stykać, a czynnikami rozpuszczalnymi, wydzielanymi do otaczającego medium, które dyfundują do komórki znajdującej się nieco dalej. Często w przypadku hodowli współdzielonych, gdy komórki wywierają na siebie wpływ, nie było jasne, czy kluczową rolę odgrywają oddziaływania kontaktowe, czy też czynniki wydzielnicze.